[發明專利]動物皮毛中9種芽孢桿菌16s rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析方法

無效

• 申請號: 201010160371.8
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101993953A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 肖西志;鄧明俊;朱來華;高宏偉
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于進出境動物皮毛中常見芽孢桿菌(包括致病的芽孢桿菌)的指紋分析方法。?

背景技術

隨著我國對外貿易的擴大以及我國在世界經濟發展角色的轉變，我國已成為動物皮革加工及出口的國家之一。皮革加工是一個高污染的產業，發達國家為保護環境已經將其轉移到發展中國家。目前我國皮毛的進口國有美國、法國、阿根廷、烏拉圭、加拿大、新西蘭、比利時等。動物皮毛中含有大量的細菌，雖然大多數為非致病菌或條件性致病菌，但如果動物的皮毛來源于患病動物，那么所進口的皮毛中必定攜帶有這些致病菌，如炭疽桿菌、結核桿菌、布氏桿菌等。炭疽桿菌作為進出境皮毛的法檢項目已實施多年，但檢出率很低，基本上沒有。但這并不能說明皮毛中不含有炭疽桿菌，主要是由于目前所用的標準方法的靈敏性不高，而且容易出現假陽性的結果。?

基于DNA的檢測方法已越來越多的被當前檢驗檢疫行業標準所采納，成為對大宗貨物進行篩查的方法之一。細菌的16s?rDNA是非常保守的一段序列，通過對其序列的分析，可將細菌鑒定到屬，甚至是種。同時，對其序列的分析發現，各個細菌的16s?rDNA具有限制性片段多態性?；诩毦?6s?rDNA的PCR-RFLP(PCR-限制性片段長度多態性)可以建立各種細菌(本專利主要是針對動物皮毛中常見的9種芽孢桿菌)指紋圖譜，因此可以通過對皮毛中的細菌進行16s?rDNA的PCR-RFLP分析，與所建立的指紋圖譜進行比對，即可得出是哪種芽孢桿菌，從而進行鑒別。?

該方法操作簡便、靈敏、特異、快速、重復性好等優點。目前國內外還沒有建立針對動物皮毛中芽孢桿菌的16s?rDNA的PCR-RFLP指紋圖譜，本發明可彌補目前方法的缺陷，準確完成動物皮毛中芽孢桿菌的鑒定。?

發明內容

本發明主要是應用17種內切酶對芽孢桿菌16s?rDNA進行切割，從而建立9種芽孢桿菌的16s?rDNA指紋圖譜。?

本發明的主要原理為：針對9種芽孢桿菌的16s?rDNA，利用通用引物27f和1492r進行擴增，擴增產物用17種內切酶分別進行切割，經瓊脂糖凝膠電泳后，顯示出各個芽孢桿菌的特異性指紋譜圖。?

具體實施方式

(1)常規方法分離鑒定皮毛中的芽孢桿菌，分離到8種芽孢桿菌，炭疽桿菌為軍事醫學科學院提供的核酸樣本。?

(2)細菌總DNA的提取?

利用細菌DNA提取試劑盒，分別提取9種菌的總DNA，步驟按照試劑盒操作說明。?

(3)PCR?

利用細菌16s?rDNA通用引物對提取的細菌DNA進行16s?rDNA擴增。?

(4)RFLP?

用17種內切酶對PCR產物進行切割。17種內切酶及其排布順序如下：?

AvaI，BamHI，Bg?II，DraI，EcoRI，EcoR?II，HindIII，Hinf，HpaI，PstI，SmaI，TaqI，XbaI，XmaI，AluI，XhoI，PvuI。?

(5)瓊脂糖凝膠電泳?

對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳膠為2％的瓊脂糖凝膠。?

(6)PCR-RFLP指紋圖譜的建立?

對所得圖譜進行分析，顯示各個菌的譜圖能相互區分，表明各個菌的指紋圖譜具有特異性，可作為其他菌株PCR-RFLP比對的基礎。?

圖1是分離的一種芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

?圖2是分離的另外一種芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖3是側芽短芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖4是環狀芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖5是枯草芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖6是蠟樣芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖7是耐熱芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖8是橋石芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖9是球型芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖10是蘇云金芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜；?

圖11是炭疽芽孢桿菌的16s?rDNA?PCR-RFLP圖譜。?

比對，所分離的2種菌分別與圖9和圖10吻合，因此鑒定為蘇云金芽孢桿菌和球型芽孢桿菌。?