[發明專利]家畜驢的一種抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和應用

無效

• 申請號: 201010159387.7
• 申請日: 2010-04-29
• 公開（公告）號: CN101845092A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 于海寧;王義鵬;遲連利;孫文敬;馮菲菲
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12Q1/18;G01N21/31
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

技術領域

本發明提供家畜驢(Equus?asinus)的一種cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和應用，屬于生物醫學技術領域。

背景技術

Cathelicidin是一類由N端信號肽區域、中間保守cathelin結構域和C端高度特異的成熟肽區域構成的具有多功能的抗菌肽家族，在幾乎所有種類的動物體內(哺乳類、鳥類、兩棲類和魚類)都有發現。與防御素(defensin)一樣，Cathelicidin是包括人類在內的大多數脊椎動物所特有的宿主防御肽，構成了脊椎動物自然免疫反應的關鍵組分，是連接自然免疫和特異性免疫的橋梁。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強的殺菌活性，而且對許多臨床耐藥細菌同樣具有作用。除此之外，Cathelicidin還具有許多其他生物學活性，如對多種免疫細胞(中性粒細胞、單核細胞、肥大細胞和T細胞)具有趨化作用、誘導肥大細胞脫粒和組織胺釋放、調節巨噬細胞轉錄、促進傷口愈合、誘導血管發生、誘導變異細胞系細胞凋亡和淋巴細胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或異常表達都將導致人類嚴重疾病的發生。最新研究發現，系統性紅斑狼瘡和牛皮癬的發病與人體內Cathelicidin?LL-37的過度表達有關。由于具有如此眾多的活性，Cathelicidin一直是國際上研究的熱點。針對Cathelicidin的藥用開發則蘊含著巨大的臨床治療藥物制備價值。

由于近年來抗生素的濫用，導致致病性微生物耐藥性的問題日益嚴重，在臨床上已經出現了大量能夠完全耐受青霉素等傳統抗生素的微生物。Cathelicidin成熟肽表現抗微生物肽的典型特征：大多數Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH條件下帶凈正電荷，緣于它們含有多個堿性氨基酸殘基；富含疏水堿基，整體具有兩親性的拓撲結構。體外抗微生物測試中，大多數Cathelicidin成熟肽可以在微摩爾和亞微摩爾的濃度下快速殺死廣泛的微生物。Cathelicidin抗微生物肽的殺菌機制是通過破壞細菌細胞膜的完整性介導的：通過靜電相互作用吸引并結合到帶負電的細菌細胞膜表面，進一步在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，導致細菌細胞內容物的外泄，從而導致細菌細胞的死亡。而傳統抗生素主要是作用于細菌細胞內的一些酶類。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介導的殺菌作用遠遠快于傳統抗生素，并且不易產生耐藥性。除此之外，越來越多的文獻報道表明抗菌肽還具有其他的殺菌機制，如抑制細菌細胞壁合成、改變細菌細胞質膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細胞內酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質的合成等。

目前，國外有許多公司正在進行抗微生物肽的研究開發，已有多種抗菌肽進入臨床試驗階段。如來源于人lactoferrin的hLF-1-1用于治療骨髓干細胞移植相關的感染，已進入臨床II期。來源于非洲爪蟾magainin的MSI-78對糖尿病患者的足部潰瘍有顯著療效且副作用小，已進入臨床III期試驗階段。來源于豬protegrin的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰瘍，已進入臨床I期試驗。除此之外，一些用于傷口愈合，內毒素感染，腫瘤，病毒感染的抗菌肽也已進入臨床試驗階段。

由于世界范圍內對Cathelicidin的研究歷史并不長，我國在此類活性多肽家族的研究還鮮有報道。家畜驢是我國本土養殖的具有多種經濟價值的大牲畜之一，全國范圍分布的大大小小的肉驢養殖場多達上千家。由于驢的飼養成本低，驢肉本身的營養價值高，所以驢肉生產是一項極具開發潛力的新型肉食品，此外，驢是具有較高藥用價值的動物，肉用驢的皮經煎煮濃縮制成的固體膠稱阿膠，又稱驢皮膠，是我國的傳統中藥材。其肉、皮、骨、毛、蹄、陰莖、脂肪和乳亦可以入藥。然而，對其活性成分和藥理性質的研究主要集中于有機小分子，對其活性蛋白肽類物質研究還尚未有報道。

本發明的家畜驢抗微生物肽Ea-CATH1分子量更小，比至今已經鑒定的大多數cathelicidins均小(如金環蛇cathelicidin-BF?30個氨基酸，雞fowlicidin232個氨基酸等)。殺菌作用更強(相比較于傳統抗生素氨芐青霉素和卡那霉素，及人cathelicidin?LL-37)、更廣譜，對多種臨床耐藥菌有非常強的殺滅作用。結構簡單，不含有二硫鍵及環狀結構。殺菌動力學數據顯示其殺菌作用時間迅速、且對多種臨床耐藥菌有非常強的殺滅作用。此外還具有無溶血性、及超強的血清穩定性等有益特點。

發明內容