[發明專利]一組蛇毒來源的活性肽的制備方法及其在抗腫瘤方面的應用

有效

• 申請號: 201010158898.7
• 申請日: 2010-04-29
• 公開（公告）號: CN102234314A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發明（設計）人: 吳勇;馮軍;張喜全;徐宏江;薛春佳;馬宇旋
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;江蘇正大天晴藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K5/093;A61K38/06;A61P35/00
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技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種用化學方法制備N端為焦谷氨酸的肽類化合物，以及這類肽化合物在抗腫瘤領域的具體用途。

背景技術

蛇毒是由毒蛇的毒腺分泌的天然混合物，包括蛋白、多肽和酶類，具有抗凝、鎮痛、促進神經生長和抑制腫瘤細胞生長等生物活性，是研究開發新藥的重要天然化合物庫之一。蛇毒中的抗腫瘤組分主要有解離素、細胞毒素和能誘導細胞凋亡的酶類及其他蛋白和多肽因子。CN101177452A公開了從斷尾蝮蛇中制備具有抑制腫瘤細胞侵襲和轉移活性的解離素的方法；CN101270159A公開了一種抗腫瘤細胞毒素，分子量為6kDa；CN101429525A公開了表達抗腫瘤轉移的蛇毒金屬蛋白酶抑制劑的方法，該抑制劑分子量為46kDa；CN1781551A公開了一種蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑，能夠抑制腫瘤細胞侵襲，其分子量約為100kDa。這類大分子蛋白在發揮其抗腫瘤活性的同時，也表現出了強免疫原性以及易被蛋白酶水解，半衰期短等缺點，故而制約了其臨床應用。因此，有必要利用蛇資源，開發蛇毒中的小分子抗腫瘤藥物。

Kai-Fa?Hang等曾報道了在竹葉青蛇毒中發現了3個分子量在1000以下的具有抑制金屬蛋白酶活性的小肽，參見：Kai-Fa?Hang，Chin-Chun?Hang，Shih-Hsiung?Wu等，Characterization?of?Three?Endogenous?Peptide?Inhibitors?forMultiple?Metalloproteinases?with?Fibrinogenolytic?Activity?from?the?Venom?ofTaiwan?Habu(Trimeresursu?mucrosquamatus)，Biochemical?And?BiophysicalResearch?Communications.1998，248：562-566。這三個具有抑制金屬蛋白酶活性的小肽均為三肽，且其N末端均是焦谷氨酸。CN101058572A公布了從皖南尖吻蝮蛇中分離具有抑制肝腫瘤細胞增殖活性小肽的方法，其分子量為429，與上述Kai-Fa?Hang等報道的三個多肽中的其中一個為同一物質。總體上目前對蛇毒中小分子活性肽，特別是3KDa以下的短肽的研究開發還遠不及大分子蛋白深入。同時小分子活性多肽在粗毒中含量非常低，因而從少量粗毒樣品中提取活性肽往往達不到研究用量，從大量粗毒原料中雖然能夠獲得足夠量的活性肽，但是顯然增加了研究和開發成本。鑒于小分子肽類化合物僅由幾個到幾十個氨基酸構成，序列較容易確定，因而利用多肽固相合成技術可以很容易制備大量活性肽，解決了從粗毒中提取量少的難題。但是某些蛇毒活性肽的N端常為焦谷氨酸，具體參見：梁寧生，蛇毒中的降壓組分-血管緊張素轉化酶抑制劑，中國《蛇志》雜質，1993，5(3)2-5。焦谷氨酸是谷氨酸通過環化后形成的，該步反應是在蛇毒的毒腺中通過焦谷氨酸化酶催化完成的，但是目前暫沒有從蛇的毒腺中提取焦谷氨酸化酶或利用其它手段將多肽N端谷氨酸環化的報道。由于現有的固相合成技術通常只能夠提供N端是谷氨酸的多肽，因而需要對N端谷氨酸進行環化處理，以達到預期的活性。

發明內容

本發明的一個方面提供了一種制備N端為焦谷氨酸的寡肽的方法，該方法包括：

方法(一)：將N端為谷氨酸的寡肽樣品溶解在pH值2～6的緩沖液中，加入催化量的CuCl₂，于60～95℃加熱，將溶液冷凍干燥后即得相應的N端為焦谷氨酸的寡肽。或

方法(二)：將N端為谷氨酸的寡肽樣品在固相下均勻加熱，得到相應的N端為焦谷氨酸的寡肽。其中，均勻加熱的方式例如：將樣品在導熱良好的金屬板上鋪成薄層然后加熱，為達到此目的可以采取其他類似的加熱手段，如微波加熱、鋪成薄層光照加熱等。

上述方法中，其中寡肽是指氨基酸數目少于等于10的多肽，優選氨基酸數為3的寡肽。