[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號的旁側(cè)序列及定性PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010158858.2
• 申請日: 2010-04-29
• 公開（公告）號: CN101824411A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王渭霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號的旁側(cè)序列，以及轉(zhuǎn)基因水稻科豐6 號的定性PCR檢測方法。

(二)背景技術(shù)

水稻(Oryza?sativa)是一種主要的糧食作物，也是較早成功應(yīng)用轉(zhuǎn)基 因技術(shù)進(jìn)行遺傳改良的作物。目前已經(jīng)培育出了包含不同性狀的轉(zhuǎn)基因水 稻品種。我國目前尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的商品化生產(chǎn)，但有一些品種(品 系)已獲準(zhǔn)環(huán)境釋放和生產(chǎn)性實驗。對轉(zhuǎn)基因作物的有效監(jiān)管是安全利用 轉(zhuǎn)基因作物的前提和保障。而轉(zhuǎn)基因植物外源插入片段的旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基 因植物品系最重要的分子特征之一，因此，依據(jù)外源插入片段的旁側(cè)序列 是建立轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測方法的重要技術(shù)資料。

自2000年Zimmermann等利用反向PCR技術(shù)破譯了轉(zhuǎn)基因玉米 Bt11的側(cè)翼序列、建立了Bt11的品系特異性檢測技術(shù)體系以來，目前已 有多個作物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體都建立了相應(yīng)的檢測方法。在對現(xiàn)有專利和文獻(xiàn) 的分析基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)已有一個關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號的外源插入片段的 旁側(cè)序列的專利(專利號200710063780.4)，由于在科豐6號中外源基因 是多拷貝插入，而該專利涉及的僅是其中1個拷貝的旁側(cè)序列。

(三)發(fā)明內(nèi)容

針對科豐6號為多拷貝插入，本發(fā)明提供了另外兩個拷貝的外源插入 序列的旁側(cè)序列，并在此基礎(chǔ)上提供該品系外源兩個拷貝的轉(zhuǎn)化事件特異 性檢測方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為載體RB側(cè)序 列，所述旁側(cè)序列為SEQ?ID?No.1所示的序列。

一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為載體LB側(cè)序 列，所述旁側(cè)序列為SEQ?ID?No.2所示的序列。

所述RB側(cè)旁側(cè)序列可通過HiTail-PCR擴增得到。HiTail-PCR所用 特異性嵌套引物依據(jù)nos終止子(NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號DQ005463)的 序列設(shè)計。其中N1-1位于NOS序列的11-36，序列為 TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTT；N_1-2位于29-54，序列為 AGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGC；N_1-3位于204-223，序列為 AGCGCGCAAACTAGGATAAA

所述LB側(cè)旁側(cè)序列可通過HiTail-PCR擴增得到。HiTail-PCR所用 特異性嵌套引物依據(jù)hyg抗性基因(NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號AB303069.1) 的序列設(shè)計。其中Hpt_1-1位于427-404，序列為 CGTACACAAATCGCCCGCAGAAGC；Hpt_1-2位于398-375，序列為 CCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAG；Hpt_1-3位于358-338，序列為 GGAAACCGACGCCCCAGCACT。

本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方 法，所述方法是根據(jù)SEQ?ID?No.1或SEQ?ID?No.2所示的序列設(shè)計特異性 引物，對待測樣品DNA進(jìn)行擴增，若擴增獲得目的片段(目的片段大小 由引物決定)，則待測樣品為轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號；若擴增未獲得目的片 段，則待測樣品不是轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號。通常待測樣品為單一水稻品種， 按照上述方法可直接得出結(jié)論；若待測樣品為混合物，則可按照上述方法 判斷混合物中是否含有轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號。

具體的，所述特異性引物如下：

KF6-1-F：5’-CGACAAAAGATCAGGATTTGGG-3’

KF6-1-R：5’-GTTTGGAGTTTAAGAGCGA-3’

上述引物對中一條引物為依據(jù)SEQ?ID?NO.1中169～189位設(shè)計為正 向引物，另一條引物依據(jù)450～468位設(shè)計為反向引物。利用該引物進(jìn)行 擴增，其目的片段為303bp。

或者，所述特異性引物如下：

KF6-2-F：5’-GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG-3’，

KF6-2-R：5’-TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG-3’