[發明專利]重組半乳糖凝集素-1二串體蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 201010158056.1
• 申請日: 2010-04-27
• 公開（公告）號: CN101830975A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 張英起;李晶;張偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;C07K1/18
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種重組半乳糖凝集素-1二串體蛋白，其特征在于，通過甘氨酸和絲氨酸串連兩分子的半乳糖凝集素-1，其連接方式為：Galectin-1-Gly-Ser-Galectin-1，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種編碼所述的重組半乳糖凝集素-1二串體蛋白的表達載體，其特征在于，包含如SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。

3.如權利要求2所述的編碼所述的重組半乳糖凝集素-1二串體蛋白的表達載體，其特征在于，所述的編碼重組半乳糖凝集素-1二串體蛋白的表達載體，為pET-22b(+)-Gal-1②表達載體，通過Nde?I和Sal?I酶切位點將SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列克隆到pET-22b(+)表達載體中。

4.一種重組半乳糖凝集素-1蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)通過Nde?I和Sal?I酶切位點將SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列克隆到pET-22b(+)表達載體中，構建pET-22b(+)-Gal-1或pET-22b(+)-Gal-1②表達載體；

2)將pET-22b(+)-Gal-1或pET-22b(+)-Gal-1②表達載體轉化感受態細胞BL21，經過篩選獲得成功轉染的單克隆菌落；然后挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素100mg/L的LB培養液中，搖床37℃培養過夜，次日以1∶100的比例轉接于新鮮的含氨芐青霉素100mg/L的LB培養液中，37℃繼續培養至細菌密度達到OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，誘導4h后后離心收集菌體；

3)將收集的菌體裂菌后，離心收集上清；將收集的上清于透析液中4℃充分透析，透析后的上清上樣于透析液平衡過的陰離子交換層析柱，然后用透析液充分洗柱，再用洗脫液A線性梯度洗脫5～10個柱體積，收集目的蛋白洗脫峰I；

所述的透析液為：pH?7.4的20mmol/L?Tris-HCl，1mmol/L?EDTA；所述的洗脫液A為：pH?7.4的20mmol/L?Tris-HCl，1mmol/L?EDTA，1mol/L?NaCl；

將收集的目的蛋白洗脫峰I稀釋并調pH至4.0，并于平衡液4℃充分透析；將透析過的蛋白洗脫峰I上樣于平衡液平衡過的陽離子交換層析柱，然后用洗脫液B線性梯度洗脫5～10個柱體積，收集目的蛋白洗脫峰II，將其透析于50倍體積的PBS后，用濾膜過濾除菌，得到純化后的目的蛋白；

所述的平衡液為：pH?4.0的20mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1mmol/LEDTA；所述的洗脫液B為：pH?4.0的20mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1mmol/L?EDTA，1mol/L?NaCl。

5.如權利要求4所述的重組半乳糖凝集素-1蛋白的制備方法，其特征在于，所述的菌體裂菌是將收集的菌體按1g菌體加10ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴超聲破菌20min；所述的裂菌緩沖液為：pH?8.0的20mmol/LTris-HCl，100mM?NaCl，1mmol/L?EDTA。

6.如權利要求4所述的重組半乳糖凝集素-1蛋白的制備方法，其特征在于，所述的陰離子交換層析柱為Q-Sepharose?FF陰離子層析柱，所述的陽離子交換柱為SP-Sepharose?FF陽離子層析柱。

7.如權利要求4所述的重組半乳糖凝集素-1蛋白的制備方法，其特征在于，所述的線性梯度洗脫為：0％～100％的洗脫液線性洗脫。

8.如權利要求4所述的重組半乳糖凝集素-1蛋白的制備方法，其特征在于，所述的上樣時的流速為1ml/min。