[發(fā)明專利]一種毛細(xì)管固相微反應(yīng)器及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010157307.4
• 申請日: 2010-04-27
• 公開（公告）號: CN102236003A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張祥民;陶芊;高明霞;陳奇
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/56;G01N30/74
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 包兆宜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，涉及一種毛細(xì)管固相微反應(yīng)器。尤其涉及一種用于微量蛋白熒光標(biāo)記的毛細(xì)管固相微反應(yīng)器及其制備方法。本發(fā)明還涉及該固相微反應(yīng)器的使用方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，各種生命現(xiàn)象都要通過蛋白質(zhì)的生物功能來體現(xiàn)，因此蛋白質(zhì)的分析越來越為人重視。然而，取得可供常規(guī)分析所需量的蛋白質(zhì)樣品一直是一個難題。這一方面受生物樣品來源稀少的影響(珍貴樣品或微區(qū)分析)；另一方面，對于控制一些重要生理過程的關(guān)鍵蛋白，其本身濃度就比較低。

毛細(xì)管高效液相色譜和毛細(xì)管電泳是上世紀(jì)末以來發(fā)展起來的分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，具有高靈敏度，低進樣量，分析速度快，節(jié)約試劑，成本低廉等優(yōu)點，是微量蛋白分析的有力工具。柱上光度檢測法經(jīng)常用于毛細(xì)管柱的分離檢測。然而，作為常規(guī)高效液相色譜通用檢測器的紫外(UV)檢測器由于受毛細(xì)管柱上光程的限制，其蛋白檢測限一般限制在10^-6M內(nèi)。與紫外檢測相較，采用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)(LIF)一般可把信噪比提高百倍以上，對可激發(fā)出天然熒光的蛋白的檢測限可降至10^-10M，對其他蛋白卻無法檢測。

針對上述不足，許多蛋白熒光衍生方法被開發(fā)出來，通過衍生反應(yīng)為蛋白標(biāo)記上熒光標(biāo)簽，使不能被激發(fā)出天然熒光的蛋白也能得到檢測。通常這種衍生反應(yīng)需要mM級的高濃度蛋白，10^-6M以下低濃度蛋白很難被衍生；通過超濾或凝膠柱除去過量熒光標(biāo)記試劑的常規(guī)方法也很難應(yīng)用于微升級的樣品，相應(yīng)產(chǎn)生的高熒光背景一般會掩蓋目標(biāo)蛋白的信號。以上問題制約了微量蛋白樣品的熒光檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備簡單，成本低廉的用于微量蛋白熒光標(biāo)記的毛細(xì)管固相微反應(yīng)器及其制備方法。

本發(fā)明的基本思想是：通過固定在毛細(xì)管內(nèi)的固相載體捕集流經(jīng)毛細(xì)管的微量蛋白，經(jīng)熒光衍生試劑標(biāo)記后，將熒光標(biāo)記產(chǎn)物從固相載體上洗脫，進行液相色譜分離和激光誘導(dǎo)熒光檢測。

本發(fā)明采用溶膠凝膠法制備毛細(xì)管柱塞，用勻漿法將固相載體填充于毛細(xì)管內(nèi)，蛋白溶液在流經(jīng)固相載體時被捕集并經(jīng)熒光衍生試劑標(biāo)記，隨后熒光標(biāo)記產(chǎn)物從固相載體上洗脫，進行液相色譜分離和激光誘導(dǎo)熒光檢測。

本發(fā)明提出的毛細(xì)管固相微反應(yīng)器，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，它包括：毛細(xì)管微通道(1)，毛細(xì)管內(nèi)柱塞(2)和固相載體填充床(3)。

所述的毛細(xì)管微通道(1)，一端用于進樣，與注射泵相連；

所述的柱塞(2)位于毛細(xì)管微通道(1)另一端，采用溶膠凝膠法制備；

所述的固相載體填充床(3)緊密填充于柱塞(2)后，采用勻漿法填制。

本發(fā)明中，毛細(xì)管微通道內(nèi)徑10～1000μm，固相載體填充床的長度為1～20mm。

本發(fā)明中，柱塞材料一般采用對蛋白及熒光標(biāo)記試劑惰性的材料，如硅膠填料。

本發(fā)明中，固相載體的材料可以是各種色譜填料(包括氣相色譜或液相色譜的填料)，也可以是一切具有捕集能力的固體材料，包括為多孔高分子聚合物顆粒以及高分子聚合物整體多孔床材料，以及為有機-無機材料雜和的顆粒或整體床材料。固相載體可以是單一均相的，也可以是多相的。

本發(fā)明提出的毛細(xì)管固相微反應(yīng)器，其制備方法如下：

(1)挑選合適內(nèi)徑的毛細(xì)管，內(nèi)壁清洗干凈后用氮氣吹干；

(2)采用溶膠凝膠法在毛細(xì)管一端制備柱塞；

(3)采用勻漿法向毛細(xì)管內(nèi)填制所需固相載體的填充床。

本發(fā)明中，所述的固相載體可以更換，其方法是用緩沖溶液從柱塞端灌入，將廢棄的固相載體沖出，然后從毛細(xì)管另一端用勻漿法重新灌入所需的固相載體。

本發(fā)明進一步提供該固相微反應(yīng)器的使用方法，可以方便地處理小體積和低濃度蛋白樣品。

本發(fā)明提出的毛細(xì)管固相微反應(yīng)器可用于微量蛋白的熒光衍生，特別是小體積和低濃度蛋白樣品。其步驟如下：

1～100μL蛋白樣品以1～10μL/min的流速流經(jīng)固相載體，其中所用的分析樣品為含微量蛋白的樣品溶液，蛋白含量10fmol～10nmol。微量蛋白被捕集到固相載體上之后，上樣1～10μL熒光衍生試劑，其濃度為0.01～1mM，在一定條件下反應(yīng)后，先用洗脫液【1】將過量衍生試劑除去，而后用1-20μL洗脫液【2】將熒光標(biāo)記產(chǎn)物從固相載體上洗脫并收集起來，用于后續(xù)分析。