[發明專利]一種臘梅胚胎發育晚期豐富蛋白的基因及其抗低溫應用

無效

• 申請號: 201010155358.3
• 申請日: 2010-04-26
• 公開（公告）號: CN102010869A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發明（設計）人: 張世宏;謝麗霞;陳宣明;高文;陽曉紅;張莉弘;劉金亮
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/415;C12R1/19
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術領域

本發明屬分子生物學與基因工程領域，具體涉及一種臘梅胚胎發育晚期豐富蛋白的基因克隆及其應用。

背景技術

干旱、鹽漬和低溫都能引起植物水分虧缺，在這期間植物細胞積累一系列的蛋白質來保護細胞免受脫水傷害。環境脅迫除了引起代謝變化和低分子量保護性化合物的積累外，植物的許多基因可被激活轉錄，并導致植物營養組織中新蛋白的積累，特別是植物干旱、低溫誘導蛋白的研究已受到普遍關注，其中胚胎發育晚期豐富蛋白(late?embryogenesis?abundantprotein，LEA)是指胚胎發育后期種子中大量積累的一系列蛋白質，其具有親水性和熱穩定性，廣泛存在于高等植物中，且受發育階段、脫落酸(ABA)和脫水信號的調節，因此成為當前在逆境研究方面的一個重要課題。

LEA蛋白是一類親水性大家族，共同特點是由極性氨基酸組成，為親水性的多肽，甘氨酸含量＞6％，親水指數＞1.0，大多數LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸殘基。根據LEA蛋白氨基酸序列同源性和特定的序列單元，LEA蛋白被分為6組。由于各組LEA蛋白序列和可能的蛋白質結構不同，每一組LEA蛋白在水分脅迫下有不同的功能。

LEA蛋白表達受發育階段控制，但它們也能在施加外源ABA的離體胚中表達，許多營養組織在外源ABA、滲透和低溫脅迫的誘導下能產生特異的LEA?mRNA和LEA蛋白。LEA蛋白表達無組織特異性，可以在轉錄水平上被ABA、高滲透濃度和水分脅迫所誘導。植物在受到干旱脅迫時，LEA基因的高水平表達和LEA蛋白的大量積累，表明LEA具有干旱保護功能。種子在自然成熟過程中發生自燃的干化作用，LEA蛋白的作用是保護種子細胞免受由干化引起的傷害，并且在部分種類耐受寒冷凍的生理作用中具有重要意義。

LEA蛋白最顯著的物理化學特性是具有很高的親水性和熱穩定性，即使在煮沸條件下也能保持水溶狀態，同時可能形成一種離子載體為那些即將干化失水的組織細胞中的離子凝結/結晶作好準備。在干旱脫水過程中細胞液的離子濃度會迅速升高，高強度的離子濃度會造成細胞的不可逆傷害。第3組LEA蛋白中的11個氨基酸殘基組成的基元序列可形成兼性a2螺旋結構，提供一個具疏水條區的親水表面，螺旋的疏水面可形成同型二聚體，處在親水表面的帶電基團可鰲合細胞脫水過程中濃縮的離子，如Na⁺和PO³⁺。此外，組成該蛋白的大多數氨基酸殘基為堿性、親水性氨基酸，無半胱氨酸和色氨酸，這些高電荷的氨基酸殘基可以重新定向細胞內的水分子，束縛鹽離子，從而避免干旱脅迫時細胞內高濃度離子的累積所引起的損傷，同時也可防止組織過度脫水。目前，在多種植物中都有關于第3組LEA蛋白或基因的研究報道，這些基因的表達或蛋白累積與植物的滲透脅迫抗性呈正相關。萌芽3天的大麥幼苗經ABA或干旱處理后，幼苗的所有器官中均有高水平的HVA1?mRNA和蛋白質出現，它可被干旱等環境脅迫和ABA誘導表達。Xu等將HVA1?cDNA全序列導入水稻，獲得了抗旱、抗鹽的轉基因水稻，從而直接證實了第3組LEA基因可能具有干旱保護功能。

LEA廣泛存在于高等植物種子中，首先是在棉花中被發現，后來相繼在大麥、胡蘿卜、小麥、大豆、番茄和向日葵植物中檢測到此類蛋白。

在眾多的研究中，并沒有看到在多抗植物臘梅中有關LEA的相關報道，而臘梅【Chimonanthus?praecox】作為一種具有多抗特性的物種，對外界環境的適應能力比較強，并且臘梅耐旱、耐寒、病蟲害較少，在臘梅中一定存在多抗基因。發明人利用本實驗室構建的臘梅花ESTs序列，從臘梅花cDNA文庫中克隆了胚胎發育晚期豐富蛋白基因(CpLEA3)。構建了臘梅LEA基因的表達載體，使表達菌株表達該基因的編碼蛋白，通過低溫脅迫后測菌落生物活性以及細胞膜通透性損傷情況，發現CpLEA3基因能提高菌株的抗低溫能力，因而本發明具有創新性。

發明內容

(1)提供一種DNA序列，其編碼一種臘梅胚胎發育晚期豐富蛋白的基因，命名為CpLEA3；(2)提供一種利用基因工程方法得到CpLEA3編碼的蛋白；(3)提供CpLEA3在菌株抗低溫基因工程方面的應用。

本發明提供了CpLEA3基因，它具有如序列表中SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。