[發(fā)明專利]側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的農(nóng)用生物活性及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010154980.2
• 申請日: 2010-03-31
• 公開（公告）號: CN102204568A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郝雙紅;王現(xiàn)坤;魏艷
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01N63/00
• 分類號: A01N63/00;A01P3/00;A01P1/00;A01P13/00;A01P7/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的農(nóng)用生物活性及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

側(cè)柏[Platycladus?orientalis(L.)Franco]屬柏科(Cupressaceae)側(cè)柏屬(Platycladus?Spach.)，是我國特有樹種，是城市尤其是北方城市綠化常用樹種之一。側(cè)柏葉氣清香、味苦澀、微辛，具有涼血止血、清肺止咳功效，種仁可入藥，能養(yǎng)心安神、止汗?jié)櫮c。側(cè)柏葉提取物對金葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度抑菌活性，其根際土壤提取物對蘿卜等植物種子的萌發(fā)和幼苗生長有抑制作用。

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)從2005年開始研究側(cè)柏的農(nóng)藥活性，發(fā)現(xiàn)側(cè)柏各器官提取物對蘋果腐爛、葡萄白腐、葡萄黒痘等植物病原菌都有較強抑制作用，其中葉提取物的抑菌活性最好，并進一步從葉中分離到抑菌化合物8-甲基香豆素，相關(guān)研究已申請國家發(fā)明專利。然而眾所周知，植物資源是限制植物源農(nóng)藥規(guī)?；a(chǎn)和使用的主要因素之一。申請者根據(jù)宿主植物與其內(nèi)生微生物長期協(xié)同進化，而具有相同或相似次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的“內(nèi)共生理論”，從側(cè)柏中分離篩選到對多種農(nóng)業(yè)病蟲草害有顯著抑制作用的內(nèi)生真菌，相關(guān)研究未見文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是從側(cè)柏中分離篩選出代謝產(chǎn)物有農(nóng)藥活性的內(nèi)生真菌，并將該菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上以防治作物的病害、蟲害及草害。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：

側(cè)柏內(nèi)生真菌的分離篩選及其代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)病蟲草害防治上的應(yīng)用，具體包括以下步驟：

(1)側(cè)柏組織的準備：采集健康側(cè)柏的根、莖、葉。

(2)側(cè)柏組織的表面消毒與無菌檢測：將步驟(1)側(cè)柏組織經(jīng)表面消毒后，直接接種于PDA培養(yǎng)基表面，置于(27±1)℃恒溫箱培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長的組織。

(3)側(cè)柏組織內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)：將步驟(2)的無菌組織在無菌條件下切割成小片移植于PDA培養(yǎng)基上，置于(27±1)℃恒溫箱培養(yǎng)，至樣品周圍長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，備用。

(4)內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配置：每升含蛋白胨0-5.5g、玉米粉1-8g、麩皮0-10g、可溶性淀粉0-10g、葡萄糖1-8g、黃豆餅粉1-9g、CaCO₃?0.5-2.5g、NH₄NO₃?0.1-1.2g、MgSO₄?0.1-0.9?g、KH₂PO₄?0.1-0.9g，其余為無菌水。

(5)內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別裝在三角瓶中，用接種鉤挑取少許經(jīng)步驟(3)分離純化的內(nèi)生真菌菌絲于培養(yǎng)瓶中，置于(27±1)℃搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)4-5天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心，取發(fā)酵上清液。

(6)有效菌株篩選：取步驟(5)各上清液與冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基按體積1∶9混合于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后在每個培養(yǎng)基平板上放一個直徑為4mm的供試菌餅，置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，計算各菌株發(fā)酵液對供試病原菌的抑制率，從中篩選出高效抑菌內(nèi)生真菌菌株，備用。

(7)側(cè)柏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物在防治植物病蟲草害中的應(yīng)用：將步驟(6)篩選出的高效菌株，采用步驟(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，以其上清液或發(fā)酵混合物，配以適量農(nóng)用藥物輔料，制備成多種劑型的農(nóng)用藥物。

本發(fā)明(6)所述供試菌為蘋果腐爛病菌(Valsa?mali)、葡萄黑痘病菌(Elsinoe?ampelina)、棉花黃萎病菌(Verticillium?dahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium?oxysporum)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本用途發(fā)明作進一步描述。

實施例1：側(cè)柏內(nèi)生真菌的典型分離培養(yǎng)

從青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園采集側(cè)柏莖葉等組織，自來水洗凈晾干，75％乙醇浸泡5min，0.1％升汞浸泡2min，進行表面消毒，最后用無菌水漂洗5次。用無菌濾紙吸干水分備用。表面消毒后的莖組織，直接接種于PDA培養(yǎng)基表面，置于(27±1)℃恒溫箱培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長的莖組織。

在無菌狀態(tài)下，將上述無菌莖組織切成0.2cm×0.2cm的片段，接入新鮮的PDA培養(yǎng)基中，置于(27±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當樣品周圍明顯長出菌絲時，采用菌絲尖端挑取法，根據(jù)菌絲顏色，形態(tài)以及長出的先后順序，挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，反復(fù)純化直至獲得單一菌株，斜面保存編號備用。