[發明專利]水體致突變性檢測的Ames實驗微量波動法

有效

• 申請號: 201010154116.2
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101851659A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 夭建華;胡明陽;楊葉昆;魏云林;米其利;倪紅梅
• 申請（專利權）人: 云南煙草科學研究院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種水體致突變性檢測的Ames實驗微量波動法，屬于微生物技術領域。

背景技術：

一般認為，85％-90％的化學致癌物為致突變物。由于Ames試驗的重現性好，預測已經在嚙齒類動物中發現致癌作用的準確性較高。因而，Ames試驗作為任何致突變篩選計劃中不可缺少的一部分。

1976年Green[1]發明的波動試驗和傳統致畸變檢測Ames試驗均以細菌回變作為檢測終點，且在已知誘變劑的測試中，發現它能在更低的濃度下獲得陽性反應結果。后來，Gatehouse將波動試驗改良為微量法，這一創舉不僅大大減輕了工作量，而且進一步提高了波動法的靈敏性。國內有關于微量波動法實驗體系組氨酸濃度，細菌濃度，生物素濃度的報道[2]。上述方法在鼠傷寒沙門氏菌不同菌株間無通用性，并且存在待測物處理繁瑣等問題。

參考文獻：

1.Green，MHL，WJ?M.Mutagen?testing?using?trp+reversion?in?Escherichia?coli.Mutat?Res?38(3)：32，1976.

2.胡長燈，詹卓玲.微量波動試驗的影響因素及靈敏度研究.衛生毒理學4(2)：115-116，1990.

發明內容：

本發明的目的在于克服現有微量波動法檢測方法的不足，而提供一種通用于鼠傷寒沙門氏菌不同菌株的測試體系，并使待測物處理變得簡單的水體致突變性檢測的Ames實驗微量波動法。

本發明方法是在現有微量波動法檢測方法基礎上的改進。本發明方法闡述了TA97、TA98、TA100，TA102系列菌株的最佳反應條件。具體通過采用鼠傷寒沙門氏菌TA98菌株為測試菌株，二氨基芴為陽性物，通過實驗設計，分析體系中不同菌液濃度、不同S9濃度，不同陽性物濃度的實驗結果，確定了該方法的最佳反應劑量，并通過對TA97，TA100，TA102菌株反應情況分析，驗證了反應體系的通用性。

本發明相對于現有微量波動法檢測方法改進點有如下幾個方面：

1、生長培養液：生物素0.8ug/ml，組氨酸0.2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于Vogel-Bonner緩沖液。

2、溴甲酚紫(BCP)：0.15g溴甲酚紫溶于30ml?Vogel-Bonner緩沖液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示劑，微孔濾膜過濾除菌備用。

3、反應體系中細菌濃度10ul/ml，S9濃度為40ul/ml。

4、采用待測物暴露細菌24小時，加入顯色劑繼續培養48或72小時后觀察結果，即陽性孔數。

5、以濃度為橫坐標，陽性孔數的對數為縱坐標作圖，采用常規的線性回歸分擬合直線，通過常規的線性方程的計算，以斜率為依據判定待測物致畸變強度，斜率越大，即相對致突變能力越強。

本發明的方法用于水質及食品等的致突變性檢測，具有快速、操作簡便的優點，有良好的應用前景。

附圖說明：

圖1為不同劑量陽性物反應結果示意圖。

圖2為不同反應時間下反應結果示意圖。

圖3為不同菌濃度條件下反應結果示意圖。

具體實施方法：

1、菌株：

用鼠傷寒沙門氏菌MOLTOX標準菌株TA98，TA97，TA100，TA102，培養至菌濃度為10⁸。

2、S9輔助因子混合液：

制備方法依照：中華人民共和國國家標準-鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗。

3、10％S-9混合液(活化系統)：

每10ml含無菌的0.2mol/l磷酸鹽緩沖液(PH6.4)6.0ml，1.65mol/l氯化鉀溶液0.2ml，0.4mol/l氯化鎂溶液0.2ml，0.05mol/l葡萄糖-6-磷酸鹽溶液1.0ml，0.025mol/l輔酶-II溶液1.6ml和大鼠肝勻漿液(S-9)1.0ml，混勻。

4、溶液：

Vogel-Bonner緩沖液貯備液(50倍)：磷酸氫鈉按16.5g，檸檬酸10.0g，磷酸氫二鉀50.0g，硫酸鎂1.0g，加蒸餾水至100ml，溶解后滅菌。

5、生長培養液：生物素0.8ug/ml，組氨酸0.2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于上述VB?buffer。

6、溴甲酚紫(BCP)：

0.15g溴甲酚紫溶于30ml?Vogel-Bonner緩沖液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示劑，微孔濾膜過濾除菌備用。

7、陽性物：二氨基芴。