[發(fā)明專(zhuān)利]與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

無(wú)效

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• 申請(qǐng)日: 2010-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101805731A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭龍彪;錢(qián)前;馬麗蓮;姜華;曾大力;高振宇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)水稻研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京中恒高博知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

氮素是水稻生長(zhǎng)中最重要的營(yíng)養(yǎng)。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，隨著矮稈耐肥高效品種的培育與推廣，世界各國(guó)都把增施氮肥作為增加水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)業(yè)措施。然而，盡管近年來(lái)化肥用量年年增長(zhǎng)、在生產(chǎn)成本中的比重逐年增加，糧食產(chǎn)量卻一直徘徊不前。從1984年到1993年，我國(guó)化肥用量增加了81％，而糧食總產(chǎn)只增加了14.6％。而且，高氮引起的環(huán)境污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)氮肥的平均利用率只有35％，養(yǎng)分損失不僅嚴(yán)重浪費(fèi)了有限的養(yǎng)分資源，由于其向水體和大氣的排放，也帶來(lái)了令人擔(dān)憂(yōu)的環(huán)境問(wèn)題。有的地下飲用水中NO₃^-含量超過(guò)上限50mg/L，NO₃^-污染會(huì)引起許多疾病，如高鐵血蛋白缺氧癥、胃癌和幼兒畸形等。

水稻是全球半數(shù)人口的主食，我國(guó)是水稻生產(chǎn)大國(guó)，全國(guó)水稻年播種面積達(dá)4.8億畝，約占糧食作物總面積的26.6％左右。由于水稻與其他作物不同，需水量大，施肥次數(shù)多，擱田或雨量大引起的NO₃^-流失多，水稻生產(chǎn)成為目前最大的污染源之一。這一現(xiàn)象在歐洲早已引起極大關(guān)注，德國(guó)巴登符騰堡州1989年就把旱作施肥列為地下水硝酸鹽污染的重要來(lái)源，通過(guò)專(zhuān)門(mén)法律條款限制水資源保護(hù)區(qū)的旱作種植及氮肥施用量。因此，探討有限氮素供應(yīng)條件下作物高產(chǎn)高效的新途徑不僅是實(shí)現(xiàn)我國(guó)兩高一優(yōu)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)目標(biāo)所必需的，而且也是保護(hù)環(huán)境、造福子孫后代的重要問(wèn)題。

水稻育種實(shí)踐證明，利用氮素營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因培育新品種將是提高氮素利用效率和作物產(chǎn)量以及減少環(huán)境污染最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使難以鑒定、易受環(huán)境影響的農(nóng)藝性狀采用分子輔助育種已成為可能，該技術(shù)可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率，但該技術(shù)的基礎(chǔ)是必須擁有優(yōu)良的目標(biāo)基因及與之緊密連鎖的分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，用分子生物學(xué)方法以氮高效水稻品種為材料，篩選和尋找新的、而且穩(wěn)定存在的與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖的分子標(biāo)記，用于水稻輔助選擇育種及新品種鑒定，同時(shí)，根據(jù)所得分子標(biāo)記也有助于水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因的克隆。

本發(fā)明所述的氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因即氮高效基因。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記為位于水稻第2染色體上的SSR分子標(biāo)記RM5897，其核苷酸序列如下：

上游引物5’-GGCATCTTCCCCTCTCTCTC-3’

下游引物5’-CCAACCCAAACCAGTCTACC-3’。

與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記為位于水稻第2染色體上的STS分子標(biāo)記AP5756，其核苷酸序列如下：

上游引物5’-CTATTGGTGGTTAGGGCTGAT-3’

下游引物5’-AGTTGATTTAGATGTGTTTTA-3’。

上述與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖的分子標(biāo)記RM5897和AP5756，是使用下述方法得到的：

(1)氮高效基因供體親本來(lái)自中國(guó)水稻研究所的秈稻品種窄葉青8號(hào)(ZYQ8)，與普通粳稻品種京系17(JX17)進(jìn)行雜交，利用F?1代花藥培養(yǎng)獲得加倍單倍體(DH)群體，從中獲得氮高效株系DH78，通過(guò)DH78與JX17回交和自交，進(jìn)行配組和基因定位，統(tǒng)計(jì)分離群體單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類(lèi)型并計(jì)算交換值，用Mapmaker?EXP3.0b計(jì)算標(biāo)記與氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因之間的遺傳距離。

(2)用CTAB法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA。

(3)采用SSR和STS分子標(biāo)記方法進(jìn)行水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因分子標(biāo)記的篩選。

(4)篩選出一個(gè)SSR分子標(biāo)記RM5897和一個(gè)STS分子標(biāo)記AP5756，經(jīng)連鎖分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)標(biāo)記與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖，分別位于水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因的兩側(cè)。

采用SSR和STS分子標(biāo)記進(jìn)行篩選與水稻氮營(yíng)養(yǎng)調(diào)控基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法是：

(1)SSR、STS引物在親本以及他們的雜交后代間DNA多態(tài)性分析：