[發明專利]體外誘導間充質干細胞分化為神經干細胞的方法

無效

• 申請號: 201010153969.4
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101831401A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 韓忠朝;謝姜
• 申請（專利權）人: 天津昂賽細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/0775
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術領域

本發明涉及神經干細胞的制備方法，尤其是一種體外誘導間充質干細胞向神經干細胞分化的方法。

背景技術

神經系統疾病常伴有不同程度的神經功能損傷，是威脅人類生命和嚴重影響人們生活質量的主要疾病之一。神經干細胞是具有自我更新能力，并能轉化為各種神經組織細胞(包括神經元、神經膠質細胞、少突膠質細胞等)的一類細胞。研究發現，在遭受神經損傷或特定細胞因子存在的條件下，神經干細胞能夠激活并分化為神經元或神經膠質細胞，參與損傷部位的修復。因此，我們可以通過神經干細胞移植來促進損傷的神經再生。目前，神經干細胞主要從胚胎干細胞誘導獲得或直接從成年哺乳動物的中樞神經系統(主要指分布于室管膜下、紋狀體、海馬齒狀回、側腦室下帶等部位)中分離培養獲得。但是倫理學、安全性問題以及細胞來源和數量的有限，在一定程度上都限制了神經干細胞的移植應用。因此，很有必要尋找其它能夠獲得神經干細胞的途徑來克服這些限制。間充質干細胞是一群存在于多種組織中的多能干細胞，具有較強的自我更新能力和多向分化潛能，在體外不同的誘導條件下可分化為骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、神經細胞、平滑肌細胞等多種細胞。目前，國內大都采用堿性成纖維細胞生長因子(basic?fibroblast?growth?factor，bFGF)和表皮細胞生長因子(epidermal?growth?factor，EGF)直接誘導臍帶間充質干細胞向神經干細胞分化。將細胞接種于低粘附培養瓶中，在含有2％B27，20ng/mL?EGF和20ng/mL?bFGF的neurobasal?medium中培養10～20天后傳代。誘導后的細胞大約有80％左右表達神經干細胞表面標志巢蛋白(Nestin)并具有向神經元和神經膠質細胞分化的能力，其中約5％細胞表達神經元特異性表面標志MAP2；而約40％的細胞表達神經膠質細胞特異性表面標志GFAP。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種臍帶間充質干細胞取材方便、易于體外擴增、免疫源性低且合乎倫理學要求的體外誘導間充質干細胞向神經干細胞分化的方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種體外誘導間充質干細胞分化為神經干細胞的方法，在添加了bFGF、成纖維細胞生長因子FGF?8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培養體系中預誘導間充質干細胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的無血清neurobasal?medium培養體系中將預誘導的細胞定向分化為神經干細胞。

所述間充質干細胞來源自人類。

所述間充質干細胞來源包括人類的胚胎、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶組織。

所述間充質干細胞來源自人類臍帶。

所述DMEM/DF-12培養體系添加的bFGF為20～100ng/mL、FGF8為50～150ng/mL、SHH為250～750ng/mL和LIF為5～20ng/mL。

所述bFGF為50ng/mL、FGF8為100ng/mL、SHH為500ng/mL和LIF為10ng/mL。

所述的無血清neurobasal?medium培養體系添加的bFGF為20～100ng/mL、FGF8為50～150ng/mL和SHH為250～750ng/mL。

所述bFGF為50ng/mL、FGF8為100ng/mL和SHH為500ng/mL。

一種體外誘導間充質干細胞分化為神經干細胞的方法，包括以下步驟：

1)預誘導

(1)取4～6代臍帶間充質干細胞，當細胞貼壁生長至80％-90％融合時，吸除培養瓶內原有培養液，取5～10mL?0.01M磷酸緩沖液PBS輕輕加入T₇₅培養瓶內洗滌，棄去洗液；

(2)加入0.25％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形漂起時，加入1.0mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

(3)加入20mL?0.01M?PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉/分離心10分鐘；棄去上清液后，加入10mL?DMEM/F-12重懸細胞，在T₂₅培養瓶中接種2×10⁵個臍帶間充質干細胞；

(4)培養體系為含體積比濃度為10％人AB血清，100u/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的DMEM/DF12完全培養液，添加了50ng/mL?bFGF、100ng/mL?FGF8、500ng/mL?SHH和10ng/mL?LIF，總體積為5mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培養箱中培養6～8天，每3天換液一次；