[發明專利]高效解磷的丁酸梭菌A5-4及應用

有效

• 申請號: 201010153419.2
• 申請日: 2010-04-21
• 公開（公告）號: CN101851596A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 陳守文;冀志霞;周光林;馬昕;信建;柯云
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C05G3/00;C05F11/08;C12R1/145
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬農業微生物技術領域，具體涉及一株丁酸梭菌，尤其是涉及一株可在厭氧條件下高效溶解磷酸鈣和植酸鈣的丁酸梭菌的分離篩選，其制備方法與用途。

背景技術

磷對植物的生長發育至關重要，而磷供給不足已逐漸成為限制農業產出的最重要因素之一。土壤中總磷含量大約為0.04～0.1％，但是只有其中的1.0～2.5％能夠被植物吸收利用，絕大多數為無效態(難溶態)在土壤中積累，很難被植物直接吸收利用。為解決磷素缺乏獲得高產，全球每年施用將近3000萬噸磷素化肥，但是其中的80％由于吸附、沉積或固定為植物難以吸收利用的無效磷，磷肥的低利用率使得農田中施用的磷肥越來越多，不僅提高了農業成本，還造成了嚴重的環境及生態問題。

解磷微生物是土壤中能夠將無效磷轉化為植物可以吸收利用的有效磷的一類特殊微生物功能群體，在自然及農業生態的磷素生物地化循環中起到了關鍵作用；它們通過酸解、螯合、置換及分泌磷酸酶等方式將無效磷轉化為能被植物利用的有效磷(主要是HPO₄^2-和H₂PO^4-形式)。大量研究表明，施用含有解磷菌的微生物肥料對促進植物生長、改善土壤結構效果顯著。因此研究新型、高效的解磷微生物，以保持農業生態環境的平衡，對發展持續高效農業具有深遠的戰略意義。

土壤中的無效磷包括無機磷和有機磷，而有機磷又主要以植酸鹽的形式存在于動物糞便、農業副產物、生活垃圾中。農業中施入的磷肥和有機磷源有很大部分隨雨水、灌溉進入厭氧環境，成為難被作物利用的無效磷。目前研究的解磷菌主要是好氧菌，而對厭氧解磷菌的研究尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一株可以在厭氧條件下溶解磷酸鈣和植酸鈣的細菌，該菌株能夠有效提高土壤中的有效磷含量，促進植物生長，從而提高磷肥的利用率，節約磷礦資源，改善生態環境，確保農業生產的可持續發展。

本發明的技術方案如下

本發明通過分離篩選得到一株一株該菌株高效解磷的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)A5-4，該菌株已于2010年3月12日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為：CCTCC?NO：M2010052。該細菌分離自化糞池底泥中，在厭氧條件下具有高效溶解磷酸鈣和植酸鈣的能力。該菌營養需求范圍廣、易培養、成本低、耐儲存，重新施入環境中也不會導致環境污染。本發明的菌株能夠開發成一種新型的應用于水生作物栽培或水產養殖的微生物菌劑。

本發明分離的丁酸梭菌A5-4的生物學特征：

本發明分離的丁酸梭菌A5-4，為革蘭陽性厭氧菌，菌體初期桿狀，產芽胞，芽胞中生，菌體中部膨大而呈梭狀；RCM培養基上菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑。本發明的丁酸梭菌A5-4株與丁酸梭菌標準株(Clostridium?butyricum)主要生物學特征對比見表1。丁酸梭菌A5-4的16SrDNA序列在NCBI?GenBank中的序列號為：GU227149。其核苷酸序列見序列表SEQ?ID?NO：1所示。

申請人提供了一種丁酸梭菌的制備方法，其步驟如下所述：

制備丁酸梭菌A5-4一級種子液：取甘油管保藏的保藏號為CCTCC?NO：M2010052的丁酸梭菌菌種A5-4200μL，接種于裝有15ml?RCM液體培養基的試管中，于35～45℃下靜置培養8～12小時，得到丁酸梭菌A5-4一級種子液，一級種子液的活菌數≥3×10⁸個/mL；

制備丁酸梭菌A5-4二級種子液：將丁酸梭菌A5-4一級種子液按體積份3～5％接種量接入裝有丁酸梭菌A5-4二級種子培養基的培養瓶中，于35～45℃下靜置培養8～12小時，制成丁酸梭菌A5-4二級種子液，二級種子液的活菌數≥2.5×10⁸個/mL；

丁酸梭菌A5-4發酵培養：將丁酸梭菌A5-4二級種子液按體積份3～5％接種量接入裝有發酵培養基的發酵罐中于35～45℃下靜置培養48～72小時，發酵液中的丁酸梭菌A5-4的活菌數≥1×10⁹個/mL；

其中

丁酸梭菌A5-4RCM液體培養基的組分及其配比如下：

葡萄糖5.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉3.0g，胰蛋白胨10.0g，可溶性淀粉1.0g，醋酸鈉3.0g，NaCl?3.0g，補充蒸餾水至1L，調pH至7.0～7.5。

丁酸梭菌A5-4二級種子培養基的組分及其配比如下：