[發(fā)明專利]一種重組抗菌肽及其基因工程制備方法和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010151996.8
• 申請日: 2010-04-14
• 公開（公告）號: CN102220255A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設計）人: 彭永鶴;李永新;林美娟
• 申請（專利權）人: 深圳市圣西馬生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/12;C12N15/81;C07K14/47;A23K1/16;A23L3/3526;A01N63/04;A61K38/17;A01P1/00;A01P3/00;A61P31/04;A61P31/10;A61P31/12
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【技術領域】

本發(fā)明屬于生物基因工程技術領域，具體地說涉及一種重組抗菌肽，其基因工程菌制備方法及應用。

【背景技術】

目前，抗菌肽(antimicrobial/antibacterial?peptides，AMP/ABP)已成為免疫學和分子生物學研究的熱點?？咕氖且活惥哂锌咕钚缘年栯x子短肽的總稱，是生物先天性免疫的重要組成部分，廣泛存在于各種細菌，植物，動物以及人體中?？咕木哂懈咝?，廣譜抗微生物的活性特點，使其對革蘭氏陽性，陰性細菌存在較強的殺傷作用，此外還具有殺真菌，原蟲，抗病毒活性，殺傷腫瘤細胞等特點。

近年來，由于人類對抗生素的過度濫用，藥物殘留和細菌耐藥性等問題日益嚴重，不斷困擾著畜牧養(yǎng)殖業(yè)并引發(fā)食品安全問題。抗菌肽這一非專一性免疫應答產(chǎn)物，對于外界各種病原體均可產(chǎn)生免疫應答，而不存在某一特定的抗原物質(zhì)，也不易導致病原菌產(chǎn)生耐藥性。因此抗菌肽的問世推動了新型抗菌藥物的開發(fā)研制。

目前已經(jīng)從豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了12種以上不同的抗菌肽，這些抗菌肽具有不同的螺旋結構，分子量相對較小(小于10kDa)，但對多種微生物有廣譜殺滅作用。根據(jù)抗菌肽前體的基因結構、氨基酸序列特征，可將豬源抗菌肽分為4類：防御素(Defensins)超家族、Cathelicidins家族、Cecropins家族和NK-lysin。Cathelicidins和防御素是到目前為止在哺乳動物中所發(fā)現(xiàn)的兩個最大群體的抗菌肽家族。

20世紀90年代，在進行bactenecin5cDNA克隆時發(fā)現(xiàn)Cathelicidins與抗菌肽具有共同的結構特征，即N末端都含有一個Cathelin區(qū)域，所以在1995年將其命名為Cathelicidins。研究證明編碼Cathelicidins基因有4個外顯子和3個內(nèi)含子。前體區(qū)含有123～144個氨基酸殘基，包括一個29～30個殘基的信號肽和一個長約94～144個氨基酸殘基的Cathelin前段。C末端區(qū)域含有長12～97個氨基酸殘基的成熟肽段。前體區(qū)具有高度的同源性，豬種內(nèi)同源性達100％。Cathelin前段的C端區(qū)域有4個固定的半胱氨酸，形成2個二硫鍵。這些基因的5′端旁側(cè)序列含有幾個調(diào)控模體，包括參與炎癥反應和急性期應答的核因子(nuclear?factor，NF)，如核因子白介素-6(NF-interleukin-6)、核因子KB(NF-KB)、白介素-6應答元素(interleukin-6?response?element)、急性期應答因子(acute?phase-response?factor，APRF)和γ干擾素應答元素(γ-interferon?response?elements，γIRE)的位點。Cathelicidins以前肽原的形式存在，其N端為信號肽，C端是帶陽離子的成熟肽段，另有帶陰離子的Cathelin前段，可能用于中和陽離子肽段，使它在胞內(nèi)運輸、貯存時保持無活性的前肽狀態(tài)，以避免細胞毒性。在多數(shù)情況下，這些抗菌肽的Cathelin區(qū)域被蛋白水解酶水解，釋放出一級結構高度不同的陽離子抗菌肽。盡管Cathelicidins前肽原確切功能還不清楚，但研究者揣測這些分子有特異的生物學功能，而不僅僅是抗菌肽的貯存形式。

目前，已經(jīng)至少從8種哺乳動物包括豬、水牛、兔等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了30多種Cathelicidins。豬的Cathelicidins家族包括PR-39、Protegrins1～5、PMAP-23，36，37。它們都起源于骨髓細胞，組成性的以前肽(Propeptides)形式儲存在周邊PMNs(中性粒細胞)顆粒中。當PMNs激活和脫顆粒時，內(nèi)源性彈性蛋白酶把成熟肽從前肽中切割出來。在一些情況下，這些肽通過C端酰胺化進一步修飾。

PMAP-36(porcine?myloid?antimicrobial?peptide，PMAP)屬于豬髓源性抗菌肽，對其結構預測和圓二色譜分析表明PMAP-36具有兩親性α螺旋結構。體外試驗表明合成的抗菌肽具有很強的抗菌活性。PMAP-36的殺菌活性為10～50μmol/l且高于100μmol/l時也未發(fā)現(xiàn)溶解紅細胞的作用。

由于從天然來源制備PMAP-36低效耗時，純化抗菌肽產(chǎn)量極低，且費時費力，分離純化困難，從而導致生產(chǎn)成本過高，不便于大規(guī)模生產(chǎn)使用。而化學合成抗菌肽成本高，且制備過程中常需要添加毒性有機物，不能滿足安全、綠色飼料添加劑的生產(chǎn)要求。本發(fā)明采用分子生物學與基因工程的手段來克服上述難題，研制開發(fā)高效的重組抗菌肽。

【發(fā)明內(nèi)容】