[發明專利]一種提高靈芝漆酶產量的發酵方法

無效

• 申請號: 201010151147.2
• 申請日: 2010-04-20
• 公開（公告）號: CN101928699A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 姚強;宮志遠;高興喜;任鵬飛;任海霞;李瑾;曲玲;王宗秀;劉巖
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院土壤肥料研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/645;C12R1/885
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 宋玉霞

技術領域

本發明涉及一種工業用酶制劑的制備方法，具體涉及一種提高靈芝漆酶產量的發酵方法。

背景技術

漆酶(laccase)是一類含銅的多酚氧化酶（Ecl.10.3.2)，能夠氧化多種酚和芳胺類化合物，在廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、免疫檢測等方面具有廣泛的應用[洪宇植等（2005）生物工程學報21：547-552]，近年來成為國際酶工程學研究的一個熱點。漆酶廣泛存在于植物、高等真菌、細菌和昆蟲中，可從多種途徑獲得，但最有工業化生產前景的是微生物發酵法。

擔子菌中的白腐菌是一類漆酶產量較高的微生物，其中靈芝（Ganoderma?lucidum）作為一種重要的藥用真菌，近年來人們對其漆酶生產開展了較為廣泛的研究。但目前包括靈芝在內的高等真菌漆酶的生產因其產量較低，通常需要芳香類化合物或等重金屬離子的誘導[Xiao?YZ?et?al(2004)?Mycologia?96:26-35]。這些誘導物一般都具有毒性，且難于降解，添加后使發酵液處理成本增高，還易造成環境污染。近年來，人們一直在尋求新的高效漆酶生產方法，并取得一定成果，如固態發酵和漆酶基因的異源表達。固態發酵技術能夠緩解漆酶生產的環境污染問題，但發酵周期太長，不適合工業化發酵生產需要；漆酶基因的異源表達的產量往往也低于野生菌[Hong?YZ?et?al(2006)?FEMS?Microbiol?Lett?258:96-101]，這都限制了漆酶的工業化生產。

真菌誘導子是來源于真菌的一種特定的化學信號物質，具有誘導植物細胞中防衛基因表達、誘發植物過敏反應和促進植物細胞中特定次生代謝產物的合成等多種功能。利用真菌誘導子激活植物細胞中的次生代謝途徑已成為提高植物細胞培養物中目標產物產量的有效手段之一[郭文娟等（2007），中國藥學雜志?42（5）：321-324]。近年來，利用真菌誘導子處理植物培養細胞以促使細胞快速、大量合成目的次生代謝物質已成為人們普遍重視的新方法。然而，將真菌誘導子用于靈芝液體發酵培養以提高漆酶產量的研究目前尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于克服上述已有技術的不足而提供一種工藝簡單、成本低廉、效果顯著，利用真菌誘導子提高靈芝漆酶產量的發酵方法，本方法可用于靈芝漆酶的工業化生產。

本發明的目的可以通過如下技術方案來實現：一種提高靈芝漆酶產量的發酵方法，包括以下步驟：

（1）真菌誘導子的制備

將真菌誘導子菌種接種于PD液體培養基（用于絲狀真菌的培養和保藏。去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，馬鈴薯切塊后煮沸20-30分鐘，過濾收集上清溶液，加入葡萄糖，加水補充體積到1L，121℃滅菌20分鐘），在25~30℃條件下、100~180?r/min搖床中培養5~7天后，過濾得到菌絲體，采用酸解法制備真菌誘導子，具體方法如下：取菌體40g（濕重），用0.1?mol/L乙酸鈉（pH5.6）懸浮菌體，轉至組織勻漿器中勻漿10min，再加入120mL乙酸乙酯攪拌均勻后靜置24h。混合物經減壓抽慮后，菌體加入100mL去離子水，用鹽酸調pH值至2.0，然后121℃滅菌1h后，再進行減壓抽慮，濾液用0.5?mol/L的氫氧化鈉調pH至5.8，得到真菌誘導子。

（2）靈芝種子液制備

將靈芝菌種接種到PD液體發酵培養基中進行發酵培養，培養條件為搖床轉速100~180?r/min，溫度25~30℃，時間5~8天，得到靈芝種子液。

（3）真菌誘導子對靈芝細胞的誘導培養

將上述獲得的靈芝種子液轉入到新鮮PD液體培養基中，繼續振蕩培養，在靈芝細胞液體發酵培養第1~5天，加入真菌誘導子，使真菌誘導子濃度達到40~200μg/mL，然后繼續培養5~8天，過濾得發酵液。

（4）制備漆酶

??將所獲得的靈芝發酵液多次過濾，取上清液，即得漆酶粗酶液。

所述的真菌誘導子菌種為枝頂孢屬真菌頂頭孢（Acremonium?strictum），菌種編號CGMCC?No.3.2058；或木霉屬真菌木素木霉（Trichoderma?viride），菌種編號為CGMCC?No.?3.2196；或木霉屬真菌木素木霉（Trichoderma?viride），菌種編號為CGMCC?No.?3.4423，購自中國微生物菌種保藏管理委員會，普通微生物中心。