[發明專利]一種用烷烴鎖定的siRNA雙鏈及鎖定方法

有效

• 申請號: 201010149901.9
• 申請日: 2010-04-16
• 公開（公告）號: CN101824062A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 高源;劉迎春
• 申請（專利權）人: 北京歐凱納斯科技有限公司
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;C07H1/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及一種siRNA雙鏈，具體涉及一種用烷烴鎖定的siRNA 雙鏈。

背景技術

干擾RNA(RNAi，或siRNA)是近年來發現的一種抑制基因表達的 小RNA。RNAi的作用機制可以分為四步：首先，dsRNA被一種dsRNA 特異的核酸內切酶識別并被切割成含有21～23堿基的小片斷，即 siRNA，上述特殊的核酸內切酶在果蠅中稱為Dicer，Dicer同時具有 RNaseIII功能、解旋酶功能以及dsRNA結合區和PAZ結合區，它可以 識別長鏈dsRNA并將其加工成siRNA；其次，被加工成的siRNAs或導 入細胞的人工合成的siRNAs形成沒有活性的核蛋白復合體；第三，在 ATP依賴的解旋酶的作用下形成具有活性的RNA誘導的沉默復合體 (RNA-induced?silencing?complex，RISC)，ATP用以保證siRNAs?5’端 的磷酸化；第四，非ATP依賴的過程，RISC特異性的與細胞內的同源 mRNA結合后，mRNA與dsRNA中的反義鏈交換，原先siRNAs中的正 義鏈被mRNA代替，mRNA隨即被切割。切割部位大約位于siRNA結 合的中部，于是mRNA片斷由于缺少poly(A)尾或穩定的帽子結構而很 快被降解，最終導致基因沉默。

siRNA的化學穩定性差不是由于其在雙鏈形式下被降解，而是 由于在雙鏈—單鏈的雜交—解旋平衡中，其單鏈形式被RNase酶降 解造成的。根據以上原理，用非核酸分子將兩條siRNA鏈的兩端分 別連接起來，將siRNA雙鏈鎖定，siRNA雙鏈就不易解旋降解，從 而可以改善siRNA雙鏈的化學穩定性和血液容留時間。在細胞內， 可以利用細胞內存在的Dicer酶釋放被鎖定的siRNA，對靶基因的表 達進行抑制。但是，已有的修飾和連接方法對siRNA的穩定性的改 進十分有限?，F有的siRNA仍存在化學穩定性差、血液容留時間短 等缺陷。

從化學活性角度看，烷烴是最穩定的結構之一。尤其在機體內 它們可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶的水解，對生理環境的氧化、 還原、取代、消除、加成等反應及廣泛的pH環境均可耐受。從生物 學的角度看，由于烷烴親脂性，膜透性非常好，因此設計合成烷烴 鎖定siRNA將是提高siRNA穩定性和活性的理想途徑。

發明內容

本發明涉及一種用烷烴鎖定的siRNA雙鏈，該siRNA雙鏈的兩條 單鏈的兩端分別通過烷烴連接，兩條單鏈至少80％互補，其結構如通 式1所示：

其中，N表示為核苷酸；n為1-6的整數；所述siRNA雙鏈可以為 常規的各種具有干擾靶基因表達功能的siRNA雙鏈。

優選地，所述siRNA雙鏈的每條單鏈含19-50個堿基；

更優選地，所述siRNA雙鏈的每條單鏈含19-30個堿基。

本發明還涉及一種用烷烴鎖定siRNA雙鏈的方法，該方法包括如 下步驟：

1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列；

2)制備選自通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷單體；

其中，n優選1-6的整數；n1和n2優選1-3的整數；B為天然的或非 天然的核苷堿基，所述天然的或非天然的核苷堿基可以帶有常見的保 護基；

3)通過固相合成的方式，合成需要被鎖定的siRNA，并在合成 過程中將通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷單體連接到兩條 siRNA鏈的3’端和5`端，使每條siRNA鏈的3’端和5`端都含有一個末端 雙鍵；

4)在Grubbs催化劑的作用下發生烯烴關環復分解反應，即用烷 烴鏈將兩條siRNA鏈鎖定。本發明用烷烴鎖定siRNA雙鏈的方法的示 意圖如圖1所示。

優選地，所述通式2選自如下結構中的一種：

其中，R為H或常見的氨基保護基，諸如苯甲?；惐；? 乙?；?；n優選1-6的整數。

優選地，所述通式3選自如下結構中的一種：