[發明專利]一種骨形態發生蛋白-2的生物合成方法與應用

有效

• 申請號: 201010149133.7
• 申請日: 2010-04-19
• 公開（公告）號: CN101831432A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 姚菊明;張艷紅
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/47;A61L27/54;A61L31/16
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.一種重組人骨形態發生蛋白-2的生物合成方法，其特征在于依次包括以下步驟：

(1)通過逆轉錄PCR方法從人成骨肉瘤細胞MG63細胞系中獲得骨形態發生蛋白-2基因；

(2)應用DNA重組技術，構建rhBMP-2原核表達載體；

(3)rhBMP-2原核表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞，構建表達工程菌；

(4)發酵培養工程菌，進行誘導劑誘導表達；

(5)將步驟(4)所得表達產物經親和層析純化、梯度透析法復性后得到rhBMP-2。

2.根據權利要求1所述的一種重組人骨形態發生蛋白-2的生物合成方法，其特征在于：步驟(1)是用Trizol試劑提取人成骨肉瘤MG63細胞總RNA，以oligo(dT)為引物，通過逆轉錄PCR方法得到cDNA；設計全長BMP-2基因及rhBMP-2基因PCR引物，其中上游引物含有EcoR?V酶切位點，下游引物含有Hind?III酶切位點；以cDNA為模板，PCR方法得到全長BMP-2基因，將其克隆至pMD-18T載體，得到重組質粒pMD-18T-BMP2；以pMD-18T-BMP2重組質粒為模板，PCR方法得到rhBMP-2基因。

3.根據權利要求1所述的一種重組人骨形態發生蛋白-2的生物合成方法，其特征在于：步驟(2)具體是將步驟(1)得到的rhBMP-2基因克隆至pMD-18T載體，得到重組質粒pMD-18T-rhBMP2；pMD-18T-rhBMP2經限制性內切酶EcoR?V及Hind?III雙酶切后，將rhBMP2基因克隆到表達質粒pET30中，構建pET30-rhBMP2原核表達載體。

4.根據權利要求1所述的一種重組人骨形態發生蛋白-2的生物合成方法，其特征在于：步驟(3)具體是將步驟(2)構建的原核表達載體經BamHI和HindIII雙酶切確認后，轉化入大腸桿菌宿主細胞BL21菌株，構建表達工程菌。

5.根據權利要求1所述的一種重組人骨形態發生蛋白-2的生物合成方法，其特征在于：步驟(4)具體是將步驟(3)構建的表達工程菌在10ml含有25μg/ml?Kan的LB培養基中，37℃培養過夜，次日按體積比1∶100將其接種至1L含有25μg/ml?Kan的LB培養基中，37℃培養至OD₆₀₀＝0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.8mM，誘導表達6h，收集菌體。

6.根據權利要求1所述的一種重組人骨形態發生蛋白-2的生物合成方法，其特征在于：步驟(5)具體是將步驟(4)誘導表達后搜集的工程菌，經超聲破碎后離心收集包涵體沉淀，包涵體溶解后在變性條件下通過Ni離子親和層析純化rhBMP-2；將純化后的rhBMP-2通過梯度透析法復性，得到可溶性的rhBMP-2。

7.一種權利要求1至少7中任何一項重組人骨形態發生蛋白-2在生物材料、骨組織再生與修復上的應用。