[發明專利]抗H5N1型禽流感病毒的小羊駝VHH重鏈抗體及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201010148083.0
• 申請日: 2010-04-15
• 公開（公告）號: CN102219853A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 趙國屏;王穎;熊慧;嚴安;包文靜;金維榮;陳志南;孫志偉;車小燕
• 申請（專利權）人: 上海人類基因組研究中心
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/12;C40B50/06;C40B30/04;A61K39/42;A61P7/02
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種抗H5N1型禽流感病毒的小羊駝VHH重鏈抗體，其特征在于，所述小羊駝VHH重鏈抗體選自SEQ?ID?NO：1～SEQ?ID?NO：10所示的核苷酸序列。

2.如權利要求1所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊駝VHH重鏈抗體，其特征在于，所述的SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO：10所示的核苷酸序列分別編碼具有SEQ?IDNO.11～SEQ?ID?NO：20所示氨基酸序列的蛋白。

3.一種如權利要求1或2所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊駝VHH重鏈抗體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)小羊駝免疫和血凝抑制效價檢測，淋巴細胞分離，細胞總RNA抽提，cDNA合成；

(2)構建抗H5N1型禽流感病毒的小羊駝VHH重鏈抗體庫，包括：

a)設計引物；

b)優化PCR條件進行PCR反應；

c)載體酶切處理及連接步驟B形成的抗體基因片段；

d)將步驟C的連接產物及制備的電轉化感受態細菌一起電轉化得到抗H5N1型禽流感小羊駝VHH型抗體庫；

(3)優化的抗體庫的固相篩選，包括：

a)在步驟(2)構建的抗H5N1型禽流感小羊駝VHH型抗體庫中加入噬菌體進行培養，呈現噬菌體抗體庫；

b)噬菌體滴度的測定；

c)在噬菌體抗體庫中篩選噬菌體展示抗體；

d)噬菌體ELISA鑒定陽性克隆。

4.如權利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊駝VHH重鏈抗體的制備方法，其特征在于：步驟(2)的步驟A中所述設計引物具體為：

根據引導肽序列設計保守引物LP-leader：5-GTGGTCCTGGCTGCTCTW(SEQ?IDNO.21)；

在恒定區CH2區域設計保守引物GSP-RT：5-CGCCATCAATRTACCAGTTGA-3(SEQ?IDNO.22)；

在可變區FR1區域的序列信息上設計兼并引物AlpVhFR1-SfiI-MA：cctttctatgcGGCCCAGCCGGCC?ATG?GCC?CAG?KTG?CAG?CTC?GTG?GAG?TCN?GGN?GG(SEQ?IDNO.23)；

根據長鉸鏈序列設計保守引物Long-NotI：aaggaaaaaa?GCGGCCGC?TGG?TTG?TGG?TTTTGG?TGT?CTT?GGG?TT(SEQ?ID?NO.24)；

根據短鉸鏈序列設計保守引物Short-NotI：aaggaaaaaa?GCGGCCGC?GCT?GGG?GTCTTC?GCT?GTG?GTG?CG(SEQ?ID?NO.25)。

5.如權利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊駝VHH重鏈抗體的制備方法，其特征在于：步驟(2)的步驟B具體為：

1)將合成的cDNA、pfu緩沖液、dNTP、引物LP-leader、引物GSP-RT、pfu聚合酶及水在如下PCR條件下進行PCR反應：94℃預變性3min；然后按以下條件進行30個循環反應，94℃?30s，55℃?30s，72℃?50s；最后72℃延伸5m；瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物；

2)將步驟1)的PCR產物、pfu緩沖液、dNTP、引物AlpVhFR1-SfiI-MA、引物Long-NotI或Short-NotI、pfu聚合酶及水在如下PCR條件下進行PCR反應：94℃預變性3min；然后按以下條件進行20個循環反應，94℃?40s，62℃?40s，72℃?40s；最后72℃延伸5min；分別割膠回收長鉸鏈片段和短鉸鏈片段，部分樣品加A處理后，克隆、驗證、測序。