[發明專利]支原體清除試劑及其應用

有效

• 申請號: 201010148028.1
• 申請日: 2010-04-15
• 公開（公告）號: CN101851603A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 王海峰;韋有恒;曹躍瓊;高博
• 申請（專利權）人: 上海吉盛制藥技術有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及支原體清除試劑及其應用。

背景技術

支原體是細胞培養中最常見、不易被察覺和干擾實驗結果的污染物，約有30.3％～50.5％的細胞培養物中有支原體污染。培養細胞中支原體污染的來源包括：所使用的動物來源的一些產品如血清或已被支原體污染的細胞株系。細胞培養上清液中支原體的濃度可達107個/ml，而培養的細胞看起來很正常，在肉眼觀察或普通光學顯微鏡下觀察，受污染的細胞可無明顯變化。由于競爭營養及支原體有毒的代謝產物，支原體污染可顯著影響培養細胞的生理活性，使研究結果的真實性和可靠性大大下降。

多數支原體適合于偏堿條件下生存(pH7.6-8.0)，對酸耐受性差，對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。支原體最突出的結構特征是沒有細胞壁，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如β-內酰胺類、萬古霉素等完全不敏感，對多粘菌素、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最具抑制活性，臨床常用干擾蛋白合成的抗生素四環素類、大環內酯類和阻止DNA復制的抗生素喹諾酮類；氨基糖苷類、氯霉素有較小抑制作用；雙萜烯類-Tiamulin，其活性優于其它抗生素；抗腫瘤類絲裂霉素C、放線菌素D也有突出的抑制作用。但是實驗室細胞培養不同于臨床應用，而且細胞培養中，支原體很容易反復感染，對于正在實驗的重要細胞株，有必要盡快清除支原體。

發明內容

本發明的目的既是開發一種支原體清除試劑，能有效地清除支原體，不影響細胞本身的代謝。

本發明的支原體清除試劑包括下列重量百分比的組分：

氟喹諾酮類抗生素??????????1.3-1.5％

四環素類衍生物????????????0.3-0.5％

大環內酯類抗生素???????0.1-0.3％

緩沖液?????????????????97.7-98.3％。

較佳的，所述氟喹諾酮類抗生素選自莫西沙星、克林沙星和吉米沙星中的一種或多種，最佳的，所述氟喹諾酮類抗生素為吉米沙星。

較佳的，所述四環素類衍生物選自強力霉素、米諾環素、氫吡四環素、替加環素中的一種或多種，最佳的，所述四環素類衍生物為米諾環素。

較佳的，所述大環內酯類抗生素選自阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素中的一種或多種，最佳的，所述大環內酯類抗生素為阿奇霉素。

優選的，所述緩沖液包括下列重量百分比的組分：

NaOH???????????????0.2-0.6％

NaCl???????????????0.9-1％

葡萄糖?????????????5-8％

H₂O????????????????余量

本發明的支原體清除試劑在常溫下為黃色液體狀，對光與熱敏感，使用與保存必須避光，避免反復凍融，融化后如果出現結晶時為正常現象，搖動儲存管至結晶消失即可正常使用。本發明的支原體清除試劑短期內使用需避光于4℃冰箱保存，在此溫度下其最高效價能夠維持2-3周，如果需要長期保存使用需避光于-20℃冰箱凍存，在此溫度下其最高效價能夠維持一年以上。

本發明還進一步公開了本發明的支原體清除試劑用于清除支原體及預防支原體生長的用途，尤其是去除及預防細胞培養中的支原體的用途。

本發明的支原體清除試劑在用于去除細胞培養中的支原體時，只需將其加入無雙抗的細胞培養基中，在隨后的傳代時使用該培養基培養，持續一周基本可以清除支原體，對于污染嚴重的細胞可適當重復作用一個周期以達到最佳效果，推薦工作濃度為10ug/mL。為了維持清除效果，可用2～5ug/ml的濃度進行維持預防。

本發明的支原體清除試劑，其中主體抗生素屬于氟喹諾酮類，另外還包括四環素類衍生物及部分大環內酯類抗生素，用特制緩沖液混合而成，能夠最有效抑制并殺死支原體，作用周期短只需要一周便可全部殺死支原體，不影響細胞本身的代謝，并且經過處理的細胞表面光滑，黑色狀顆粒基本消失，細胞不會輕易被支原體重新感染。

附圖說明

圖1：支原體清除試劑使用示意圖

圖2：使用支原體清除試劑前后對照圖：

A：處理前DLD-1細胞?白光視野??????A’：處理后DLD-1細胞?白光視野

B：處理前DLD-1細胞?熒光視野??????B’：處理后DLD-1細胞?熒光視野

C：處理前Hela細胞?白光視野???????C’：處理后Hela細胞?白光視野

D：處理前Hela細胞?熒光視野???????D’：處理后Hela細胞?熒光視野