[發(fā)明專利]兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位體外酶解消化獲取的實(shí)驗(yàn)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010146940.3
• 申請(qǐng)日: 2010-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN101831402A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 衛(wèi)小春;段王平;孫振偉;李琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院;衛(wèi)小春
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 山西太原科衛(wèi)專利事務(wù)所 14100
• 代理人: 張彩琴;任林芳

1.一種兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位體外酶解消化獲取的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于步驟如下：

(1)、無菌條件下留取兔膝關(guān)節(jié)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將膝關(guān)節(jié)打開，刮取膝關(guān)節(jié)股骨和脛骨平臺(tái)全層軟骨，將關(guān)節(jié)軟骨反復(fù)剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗，棄上清，稱重，放置于無菌錐形瓶備用；

(2)、采用dispase酶和II型膠原酶按12mL?DMEM-F12培養(yǎng)液/g軟骨加入上述錐形瓶?jī)?nèi)，即每克軟骨加入DMEM-F12培養(yǎng)液12mL，DMEM-F12培養(yǎng)液中含有質(zhì)量/體積濃度為0.3％的dispase酶和質(zhì)量/體積濃度為0.2％的II型膠原酶，

上述兩種酶均采用無菌DMEM-F12培養(yǎng)液溶解，經(jīng)過0.22μm一次性過濾器過濾、除菌，

加入培養(yǎng)液的錐形瓶放置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進(jìn)行聯(lián)合酶解攪拌消化3h，形成消化懸液；

(3)將上述消化懸液用100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾于離心管中，1200rpm離心5min，棄上清，然后10mL無菌DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗、離心3次，加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液包括DMEM-F12培養(yǎng)基9mL及肽牛血清1mL，制成無菌的軟骨單位懸液。