[發明專利]一種香菇病毒檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201010145856.X
• 申請日: 2010-04-07
• 公開（公告）號: CN101812541A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 張忠信;應國華;呂明亮;陳春樂;孫修煉;薛振文;李伶俐;姚立
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所;麗水市大山菇業研究開發有限公司;麗水市林業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及一種農業生物技術，具體地說，涉及檢測香菇病毒所用的PCR引物和準 確快速檢測香菇病毒的RT-PCR檢測試劑盒，同時還涉及香菇病毒的檢測方法，適用于 香菇菌種的病毒檢測和香菇生產中早期病毒的檢測。

背景技術

香菇是著名的食藥兼用菌，也是我國栽培的主要食用真菌之一，隨著國際市場的開 拓和國內消費的不斷增加，生產呈逐年上升趨勢。從上世紀末到本世紀初，我國年產鮮 香菇140多萬噸。產量和出口量都居世界第一位。地處浙江南部山區的麗水市是世界人 工栽培香菇的發源地，鮮香菇年產量40-45萬噸，年出口超過20萬噸，是目前全球最 大的香菇產銷集散地。香菇的生產和出口已成為部分縣農業支柱產業和農民致富的重要 途徑。

隨著香菇栽培規模擴大，近年出現不同程度的香菇病毒病危害，給菇農帶來慘重經 濟損失。香菇病毒在菌絲體和營養生長階段感染，輕度感染病毒的癥狀一般較為隱蔽， 外觀上不易識別。嚴重帶毒菌株開始表現也不明顯，后期則表現為菌絲生長速度慢，形 狀不整齊，局部伴有缺刻或菌絲紊亂的現象。香菇在子實體生長階段感染病毒，帶毒菌 絲對不良培養環境的適應性降低，尤其是抵抗霉菌侵染的能力下降，不能萌發成子實體 或發育成畸形菇。菌絲體生長緩慢，長勢減弱，子實體畸形，質量和產量嚴重下降。病 毒感染菌株培養后期的纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶活性和對木屑培養料中纖維素、 半纖維素、木質素的降解能力比其正常菌株明顯下降。

香菇病毒的發生不僅使香菇的產量下降、品質降低，產品難以出口，特別是香菇病 毒病早期不容易辨認，或癥狀時隱時現，一旦肉眼發現香菇發生病毒病，往往已到了香 菇生產的中后期，這樣對香菇的生產造成的損失就十分巨大。同時，由于香菇病毒病發 現較晚，也對香菇菌種的無病毒育種提出嚴峻挑戰，對高質高產香菇菌種無病毒培育造 成重大威脅。因此，急需開發香菇病毒病的早期快速檢測方法，從而保證香菇生產在無 病毒感染的條件下持續生產，促進全國各地香菇生產和出口。

關于香菇病毒的研究，早在上世紀70年代就有報道。1972年，日本學者從栽培香 菇中分離到香菇病毒。1992年，我國學者也從香菇中分離到香菇病毒。這些研究主要是 從形態學上進行觀察，并沒有進行深入的分子生物學研究，只有沈學仁等從球形香菇病 毒中提取出病毒核酸，確定病毒核酸類型是RNA。由于香菇病毒基因組核酸序列的研究 還是空白，國際病毒分類委員會2005年公布的第八次報告中，香菇病毒僅作為未分類 病毒列出。香菇病毒的檢測目前主要是通過電鏡觀察檢測，另有一些酶法檢測的試驗報 道。

香菇栽培在國內外都有較長的歷史，但直到上世紀八十年代，香菇栽培主要是段木 栽培，從上世紀九十年代以來，香菇栽培一般都改為代料栽培。以代料栽培方式栽培， 香菇生長的營養條件和環境條件都發生了巨大變化。隨著香菇代料栽培的迅速增加擴 大，病毒病在香菇生長的不同階段都有出現，對香菇產業的健康持續發展構成威脅。為 了開發方便快速的香菇病毒檢測方法，近年來我們對發生在浙江、福建等地的香菇病毒 病進行了研究，發現代料栽培的香菇中，病毒主要是是長桿形顆粒，大小為20nm× 100-200nm。病毒基因組為雙鏈RNA分子，大小約8.0kb，隨后完成了香菇病毒部分基 因組的序列分析(Accession?no：GQ372842)。這些工作為開發新的香菇病毒檢測方法奠 定了很好的基礎。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種香菇病毒檢測試劑盒，該試劑盒組成成分簡單，檢 測靈敏度高，結果準確，可在香菇菌種制備階段或香菇栽培早期就對香菇病毒進行快速、 靈敏、準確的檢測，大大減少了香菇生產中病毒病造成的危害。

本發明的另一個目的是在于提供了一種香菇病毒檢測試劑盒的檢測方法，用本發明 提供的檢測方法，反轉錄(RT)和PCR一步完成，操作簡單方便；使用多對特異性引 物進行RT-PCR，可有效排除假陽性出現。香菇病毒檢測方法所需的試驗條件簡單，不 需要電鏡、超速離心機等大型儀器設備，在一般食用真菌菌種生產單位和基層研究單位 都可滿足這些試驗條件，有利于本發明在香菇栽培地區大范圍推廣應用。

為了達到上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種香菇菌病毒檢測試劑盒由以下成分組成，分別是：