[發明專利]基于B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途

有效

• 申請號: 201010144610.0
• 申請日: 2010-04-07
• 公開（公告）號: CN101824424B
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 奚永志;薛紅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院附屬醫院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/861;A61K39/00;A61K48/00;A61P19/02;A61P19/04;A61P29/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 程泳

技術領域

本發明涉及一種重組核酸構建體，其含有與真核表達載體 pcDNA3.1/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ?ID NO：1)。本發明還涉及含有與真核表達載體pcDNA3.1/Zeo(+)有效連 接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ?ID?NO：1)組成的重組表達載 體。本發明還涉及所述重組核酸構建體用于制備治療類風濕關節炎的 DNA疫苗的用途，以及包含本發明所述重組核酸構建體的治療類風濕 關節炎的DNA疫苗。本發明進一步的還涉及治療類風濕性關節炎的 方法，包括向受試者施用治療有效量的所述DNA疫苗。

背景技術

類風濕關節炎(rheumatoid?arthritis，RA)是一種抗原驅動由 CD4⁺CD28⁺Th1細胞介導的慢性全身性自身免疫性疾病，主要累及各 關節，以滑膜及鄰近組織的炎性病變為主要特征。該疾病的預后較差， 80％的病人20年后關節變形殘疾，喪失勞動力。

DNA疫苗是將攜帶抗原編碼基因的質粒直接注人動物體內，通過 在動物細胞中表達抗原蛋白以誘導動物產生免疫保護作用。與傳統疫 苗相比，DNA疫苗具有如下優點：1、不必提取靶蛋白，不必在體外 原核或真核表達，也不必對表達產物進行純化、加工；2、易操作性和 穩定性；3、外源基因在體內存在時間長，不斷表達外源蛋白，可以持 續給免疫系統提供刺激；4、能用各種投遞疫苗的方法；5、具有熱穩 定性；6、可規模化生產；7、不僅能防病，還能有效治病。1993年 Ulmer等[Ulmer?JB，et?al.Science，1993，259(5102)：1745-1749]首次報 道了肌肉注射質粒DNA可保護小鼠抵抗流感和瘧疾，標志著DNA疫 苗的誕生。它的出現代表了新的、具有潛力的疫苗發展途徑和研究方 向，被譽為繼減毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗。在隨后的 十多年里，DNA疫苗被不斷的完善和發展，由最初給動物注射重組質 粒DNA能引起外源蛋白在機體的表達，到所表達的外源蛋白能同時 引起機體的體液免疫反應和細胞免疫反應，再到該免疫反應能保護機 體免受相應病源的致命性打擊。DNA疫苗在各種小動物疾病模型中取 得的成功大大推動了其在臨床上的研究及應用。

盡管現有技術對類風濕性關節炎以及基因治療和DNA疫苗等有 了較詳盡的公開，但是，有關類風濕性關節炎的DNA疫苗尤其是否 可以通過誘導免疫耐受或/和免疫調節性細胞的策略采用基因治療性 疫苗直接有效的治療，哪些類型的DNA疫苗可能有效預防或治療類 風濕性關節炎，帶有B7-2-PE40外毒素融合基因的 pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40重組核酸構建體是否能夠在動物體內有 效表達、所表達的產物是否具有生物學功能、以及該重組核酸構建體 pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40是否可以直接作為有效預防或治療類風 濕性關節炎的疫苗，這些問題在現有技術中尚無任何教導。

因此，提供一種可有效預防或治療類風濕性關節炎的DNA疫苗 仍是本領域技術人員急需解決的。

發明內容

本發明的一個方面，涉及一種重組核酸構建體，其含有與真核表 達載體pcDNA3.1/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ ID?NO：1)。本發明的又一方面，涉及包含本發明所述重組核酸構建體 的治療類風濕關節炎的DNA疫苗。

本發明人在研究中令人意外地發現，轉染入真核細胞的重組核酸 構建體pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40經轉錄、翻譯和翻譯后修飾被分 泌到胞外，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40可在真核細胞中高效表達并 且表達產物具有很好的靶向免疫抑制活性；發明人還發現， pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗可以有效地 預防和治療大鼠類風濕性關節炎，本發明基于這些發現而得以完成。

因此，本發明提供的各個方面和特征概述如下：

本發明的一個方面涉及一種重組核酸構建體，其含有與表達調控 序列有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ?ID?NO：1)。在本發 明中，所述表達調控序列用于在真核宿主細胞中實現B7-2-PE40外毒 素融合基因的有效表達。

本發明中，所述表達調控序列選自CMV立即早期啟動子、HSV 胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白 I。