[發(fā)明專利]雞多重病毒核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010142273.1
• 申請(qǐng)日: 2010-04-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101824488A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔治中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 鄭明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雞多重病毒核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試劑盒，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在雞群中，不同病毒特點(diǎn)是免疫抑制性病毒感染已非常普遍。如I型雞馬立克氏病毒(Marek’s?disense?Virus，Serotyres，MDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(ReticuloendotheliosisVirus，REV)、雞傳染性貧血病毒(Chick?infectious?anemia?Virus，CAV)、禽呼腸孤病毒(Avian?Reovirus，ARV)、雞傳染性支氣管炎病毒(chicken?infectious?bronchitis?virus，IBV)N蛋白基因(IBV-N)。這些病單獨(dú)感染雛雞后，除在少數(shù)雞引起特定病理變化和癥狀甚至死亡外，對(duì)多數(shù)雞往往只顯示輕微的致病作用，只呈現(xiàn)亞臨床感染。但是，如果有二種或二種以上病毒同時(shí)感染一只雞時(shí)，它們?cè)谥虏⌒陨系膮f(xié)同作用可能使病程更為嚴(yán)重。在雞場(chǎng)遇到的一些發(fā)病死亡，往往是不同病毒和細(xì)菌共同感染的結(jié)果。因此，如果能對(duì)一只雞同一份樣品對(duì)不同病毒感染作病原學(xué)檢測(cè)，將有助于闡明一個(gè)雞群發(fā)病的真正原因。

本發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能對(duì)一只雞同一份樣品對(duì)不同病毒感染(I型雞馬立克氏病毒(MDV₁)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV)、雞傳染性貧血病毒(CAV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)作病原學(xué)檢測(cè)，將有助于闡明一個(gè)雞群發(fā)病的真正原因的檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所涉及的試劑盒是分別利用MDV₁特異性的pp38基因、CAV的vp₁基因、REV的pol基因和ARV的sigma?c基因、IBV-N蛋白基因?yàn)槟０澹锰囟ㄒ锿ㄟ^(guò)PCR合成了經(jīng)狄高辛(Digoxiaenin，DIG)標(biāo)記的特異性核酸探針。通過(guò)斑點(diǎn)分子雜交，這些探針將可用于檢測(cè)病料樣品中某種病毒特異性核酸的存在，用于判定有無(wú)某種病毒感染。利用這一方法，在1張8×8cm大小的硝酸纖維膜或尼龍膜上可同時(shí)檢測(cè)約100份病料的核酸樣品。病料在組織樣品核酸提取后，斑點(diǎn)分子雜交可在24～36小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)并報(bào)告結(jié)果。如將同一樣品的核酸提取物分點(diǎn)在五張膜上，即可同時(shí)檢測(cè)四種不同的病毒。

發(fā)明的詳細(xì)描述

一、核酸探針及基因DNA對(duì)照品的制備

1.MDV

(1)MDV-pp38核酸探針標(biāo)記

1)以本發(fā)明人保存的MDV-pp38基因(姜世金，丁家波，孟珊珊等.型馬立克氏病病毒pp38和pp24基的真核表達(dá).中國(guó)病毒學(xué)，2005年20卷4期)，基因大小為981bp作為模版用所設(shè)計(jì)并合成的一對(duì)引物(序列1、2)擴(kuò)增出片段大小為641BP產(chǎn)物(序列3)，此段序列為I型MDV特異性的。

所用引物(序列1、2)

pp38-F：AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG

pp38-R：ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA

2)探針標(biāo)記反應(yīng)程序(標(biāo)記效果較好的程序)

*PCR?DIG探針合成混合物為含有DIG-11-dUTP的d?NTP的混和物，購(gòu)自Roche公司

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸50sec，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。由此合成的為有DIG標(biāo)記的641pb的探針DNA.。

(2)MDV-pp38基因DNA(未標(biāo)記對(duì)照)的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸50sec，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。由此合成如序列3所述核酸序列的為未標(biāo)記的641pb?DNA作為陽(yáng)性對(duì)照或其他基因探針的陰性對(duì)照。

(3)電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，同樣是641bp，有DIG標(biāo)記的探針DNA分子量大，電泳中變慢。(樣品各取2μl，maker2000各5μl和10μl電泳)

(4)定量結(jié)果探針標(biāo)記量為50ng/μl；共10管(1100μ1)，110μl/管(5.5μg/管)；總量為55μg。

2.REV

(1)REV-pol核酸探針標(biāo)記