[發明專利]牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗及其生產方法

無效

• 申請號: 201010141352.0
• 申請日: 2010-04-06
• 公開（公告）號: CN101954092A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 孫修勤;鄭風榮;吳謖琦;吳興安;沈志強;曲凌云;張進興;洪旭光;鄭明剛
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第一海洋研究所
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/12;A61P31/20;C12N15/34
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明涉及一種海水魚病毒病基因工程疫苗及其生產方法，特別涉及一種牙鲆淋巴囊腫病毒病基因工程疫苗及其生產方法。?

背景技術

淋巴囊腫病是由淋巴囊腫病毒引起的病毒性傳染病，具有水平和垂直雙重傳播的特點，可感染多種魚類，是在中國海水養殖魚中大規模流行的首例病毒性疾病，該病在我國重要養殖經濟魚類牙鲆、真鯛、石斑魚、鱸魚、等名貴魚種中廣泛傳播，造成了嚴重的經濟損失。目前，我國海水養殖病害控制仍以抗生素等化學藥物為主，藥物的濫用導致了水產品藥殘，嚴重影響了食品安全。此外，抗生素和化學藥品的大量使用還造成了病原微生物耐藥性增加及養殖環境惡化，妨礙了產業和經濟的發展。因此，疫苗是治療病毒病的最好選擇。基因工程疫苗是將外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組質粒DNA注射到動物體內，當外源基因進入活體細胞內并表達后，既可誘導體液免疫反應，也可誘導長期的免疫記憶，被譽為第三代疫苗，大規模制備臨床級質粒DNA的生產加工工藝逐漸受到關注，但由于基因工程疫苗不同于以往的傳統疫苗，工程菌的選擇、制備工藝和生產方法等都不成熟，更沒有相關的質量保證體系，這極大地阻礙了該產業的發展。目前，國內外獲得上市的基因工程疫苗僅有馬西尼羅病毒的基因工程疫苗West?Nile?Innovator和鮭魚傳染性出血性壞死病毒的基因工程疫苗APEX-IHN。?

發明內容

本發明的目的是提供一種牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗及其生產方法，以實現該疫苗的規模化生產，該生產方法克服了基因工程疫苗生產工藝的缺陷，彌補了現有技術的不足。?

上述牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗是由大小為0.6kb的淋巴囊腫病毒核衣殼蛋白基因MCP片段插入到真核表達載體pEGFP-N2中構成的重組質粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0.6kb，插入到基因工程疫苗中的淋巴囊腫病毒核衣殼蛋白基因MCP片段序列為：?

ATGATCGGTAATACTATTGATATGACACAACCCGTTGATTCCAATGGTCAATTACCTGAAGAAGTGTTAATACTTCCTTTACCTTATTTCTTTTCTCGAGATAGCGGTATGGCTTTACCCAGCGCTGCTTTGCCTTATAATGAAATAAGATTAACTTTTCATCTGAGAGATTGGACTGAATTATTGATCTTTCAAAATAAAAACGACTCTACCATCATGCCTTTGACAGCAGGCGATTTAGACTGGGGTAAACCTGATTTAAAGGATGTGCAAGTATGGATTACTAATGTAGTAGTAACCAATGAGGAACGTCGTTTAATGGGTACAGTACCTAGAGACATCTTGGTGGAACAGGTACAAACAGCACCTAAACATGTATTTCAACCTCTAACTATTCCAAGTCCTAATTTTGACATCAGATTTTCTCATGCCATTAAAATCCT?TTTTTTCGGTGTGCGTAATGTTACCTATCAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCTAGCGATTTACCGGGTATTGCTGCTGATCCTATTTCAAATGTTACCTTGGTTTATGAAAATAGTGCTCGTCTTAATGAAATGGGTAGTGAATAT。?

本發明的生產方法：首先制備牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗質粒庫；然后將上述牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗轉化入大腸桿菌制備生產用菌種K12?DH-5α-LCDV0.6kb；再將該生產用菌種劃線到Minca瓊脂平板、分離純化制備一級生產種子，并對其鑒定確定合格的一級種子；再將該合格的一級種子接種于若干瓊脂扁瓶中，在37℃培養后24-48h后得二級生產種子，并對其鑒定確定合格的二級種子；再將該合格的二級種子在發酵罐中無菌條件下進行發酵培養，得到發酵的二級種子培菌液；最后對該二級種子培養菌液進行菌體收集、離心、質粒DNA提取、純化，再對提取得到質粒DNA分別進行無菌、DNA純度、外源DNA含量、內毒素、蛋白質、超螺旋質粒含量的檢驗，檢測合格者即得到淋巴囊腫病半成品的因工程疫苗，再經過常規的效力檢驗和安全檢驗，合格者即為生產用牙鲆淋巴囊腫病毒病基因工程疫苗成品。詳細敘述上述各步驟如下：?