[發明專利]一種SecA ATPase抑制劑的篩選方法

無效

• 申請號: 201010141329.1
• 申請日: 2010-04-06
• 公開（公告）號: CN102212610A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 余利巖;王宇;趙莉莉;李秋萍;魏玉珍
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/32;G01N21/31
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種SecA?ATPase抑制劑的篩選方法。

背景技術

銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa，PA)，又名綠膿桿菌，是假單胞菌屬中的代表菌種。綠膿桿菌是一種非發酵革蘭氏陰性細菌，其營養要求不高，廣泛分布于醫院內各種環境。它可以引起多種類型的感染，如菌血癥、肺炎、腹內感染、傷口感染、燒傷感染、尿路感染等。由于其外膜通透性低并存在著外排多種物質的主動外排系統(Active?Efflux?Systems)，因此多為天然耐多種抗生素菌株，感染后不易被控制。綠膿桿菌對有并發癥、使用插入式導管、進行外科手術后的病人感染力特別強。研究顯示，醫院感染中超過60％的死亡率都與綠膿桿菌相關。綠膿桿菌通過感染病人，毒力可以增強；它甚至能攻擊原是健康的人們，引起敗血癥、心內膜炎、腦脊髓膜炎、胸膜炎、盆腔炎、腎炎、胰腺炎等。由此可見，綠膿桿菌是一種重要的院內感染條件致病菌，是燒傷、外科手術后呼吸道感染中的主要因素。目前的臨床治療策略包括廣譜抗生素的使用(如氟喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、三代頭孢菌素)和革蘭氏陰性菌選擇性藥物的使用(如氨曲南和哌拉西林)，近年來又推出了β-內酰胺類抗生素聯合氨基糖苷類或者氟喹諾酮類聯合治療。但是，廣譜抗生素的大量使用以及藥物的聯合治療導致了多藥耐藥株以及泛耐藥株的急速出現。近年來，除了多尼培南外沒有新的抗綠膿桿菌藥物入市。因此，迫切需要發現新型低毒、高效抗綠膿桿菌藥物。

從成千上萬個微生物代謝產物或其它來源的天然產物中篩選所?需的抗菌藥物是非常艱難的一個過程。目前開發新型有用的天然產物藥物，雖然仍有很大的潛力，但研究工作的難度越來越大，耗時越來越長，需要的資金也越來越多。為擺脫篩選的盲目性，提高效率，有必要進行定靶篩選，從細菌生存所必須的組成成分或者臨床有效抗生素的作用機理和細菌的耐藥機理來設計篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強、對耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。

Sec途徑(即分泌途徑secretion?pathway)是蛋白質轉運的主要途徑。其中，SecA?ATPase是蛋白質轉運途徑中的“動力泵”，它通過ATP的水解循環驅使蛋白質前體穿過細菌內膜，在細菌中是獨有且不可缺少的。將SecA作為篩選抗菌藥物的靶點，有望建立有效的抗菌藥物篩選模型。然而，該項工作進展緩慢，到目前為止仍然沒有有關可行方案的報道。

發明內容

針對上述不足，本發明提供一種SecA?ATPase抑制劑的篩選方法。

本發明方法包括如下步驟：

1)配置如下反應體系：

反應物????????終濃度

Hepes?????????90～110mM

MgCl₂?????????9～11mM

MnCl₂?????????1.8～2.2mM

ATP???????????9～11mM

PEP???????????0.9～1.1mM

NADH??????????1.3～1.7mM

SecAATPase????2.5～3.5μg/100μl

丙酮酸激酶????1.6～2.0U/100μl

乳酸脫氫酶????1.6～2.0U/100μl

2)設置如下各反應組：

i)樣品實驗組：向1)所述反應體系中加入適量已知濃度的樣品溶液；

ii)陽性對照組：用等體積ddH₂O代替1)所述反應體系中的SecAATPase，抑制率設為100％，該組表征SecA?ATPase的活性被完全抑制；

iii)陰性對照組：向1)所述反應體系中加入等量的i)所述樣品溶液中除樣品本身外的溶劑及溶質；

3)反應開始后，測定各反應組OD₃₄₀吸光值變化量，計算反應抑制率，對反應具有抑制作用的即為陽性樣品。

上述步驟1)優選反應體系為：

反應???????????物終濃度

Hepes??????????100mM

MgCl₂??????????10mM

MnCl₂??????????2mM

ATP????????????10mM

PEP????????????1mM

NADH???????????C1.5mM