[發(fā)明專利]乙肝病毒L基因的玉米表達(dá)載體及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010140845.2
• 申請日: 2010-03-31
• 公開（公告）號: CN101845455A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李君武
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/51;A61K39/29;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，特別涉及一種包含了乙肝病毒L基因的玉米表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒((Hepatitis?B?virus?HBV)的感染是一個非常嚴(yán)重的全球性的健康問題。目前全球60億人口中有20億人感染過乙型肝炎病毒，占全球人口三分之一。約25％的人最終將轉(zhuǎn)化為慢性肝病，包括肝硬化和肝癌。控制乙肝傳播的主要手段是接種有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防和阻斷傳播途徑，。目前應(yīng)用的乙肝疫苗主要由中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)和啤酒酵母表達(dá)的乙肝病毒表面抗原HBsAg(S蛋白)顆粒組成。在預(yù)防接種的過程中發(fā)現(xiàn)仍有10％～20％人群接種乙肝疫苗表現(xiàn)為無反應(yīng)或弱反應(yīng)，甚至根本不產(chǎn)生抗體。隨著年齡的上升，無反應(yīng)或弱反應(yīng)者增多，尤其是在艾滋病感染者、腎透析和免疫抑制病人中這種低反應(yīng)或不反應(yīng)的發(fā)生率會更高。另外，由于長期推廣乙肝疫苗后，HBVS基因變異株以弱勢準(zhǔn)種形式廣泛存在，有可能在免疫后人群中流行而成為新的公共問題。因此，研制新型免疫原性更好的乙肝疫苗是國內(nèi)學(xué)者迫切需要解決的課題。

研究表明，乙肝病毒全包膜蛋白L(包含Pre1、Pre2、S基因編碼蛋白)，其中preS1肽段含有好幾個免疫原性比S蛋白更強(qiáng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，由preS1引起的細(xì)胞特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答可以幫助克服某些人對S蛋白的免疫無反應(yīng)狀態(tài)或同時對preS1和preS2蛋白雙重?zé)o反應(yīng)狀態(tài)；preS2中也含有多個抗原表位和病毒中和位點，在疫苗制劑中加入preS1和preS2的抗原表位后，人群對傳統(tǒng)的乙肝疫苗的不反映和低反應(yīng)頻率大大降低，抗體產(chǎn)生的時間較僅有S區(qū)抗原的時間提前；因而含有乙肝病毒preS1和preS2抗原成分或HBV?S基因變異株核心蛋白成分的各種新型重組乙肝疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)更高效的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生中和乙肝病毒抗體，保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊，并可打破免疫耐受，清除乙肝病毒。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是將植物分子生物學(xué)技術(shù)與機(jī)體免疫機(jī)理相結(jié)合，使外源基因在植物中表達(dá)，免疫人體后獲得特異性抗體的新型疫苗，和其他疫苗相比有安全、高效、廉價、易運(yùn)輸、易推廣等優(yōu)點。但外源基因在植物中低表達(dá)是研究人員面臨的重大難題之一，開發(fā)并建立高效表達(dá)體系和高效植物表達(dá)載體的研究是克服該問題的重要途徑。理論上，用于生產(chǎn)口服疫苗的植物反應(yīng)器要需符合以下條件：①表達(dá)蛋白的含量較高，至少能占可溶性總蛋白0.01-0.1％；②抗原蛋白的濃度要穩(wěn)定、一致，以便定量口服；③常溫下長期保存，并保證抗原蛋白生物活性穩(wěn)定；④轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)抗原蛋白的組織要可口、服用方便；⑤種植技術(shù)普及，人人可種植。

玉米作為植物反應(yīng)器候選之一，具有其獨特的優(yōu)勢：①表達(dá)外源性蛋白的玉米種子在常溫下至少保存一年；②抗原蛋白濃度穩(wěn)定；③檢測到在轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)的LT-B蛋白占可溶性總蛋白0.05％～0.1％之間，有的達(dá)到1.8％。Jeffrey和Stephen等在對外源性基因Lt-B表達(dá)進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白被定位到液泡當(dāng)中蛋白表達(dá)量最高，其次是在細(xì)胞表面，再次是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而定位到細(xì)胞核或質(zhì)體當(dāng)中，或者不進(jìn)行定位時蛋白表達(dá)量最低。相反，Lt-B基因在煙葉中或馬鈴薯莖中表達(dá)時，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)量可達(dá)到在細(xì)胞表面的三到四倍；④玉米是全世界三大主食之一，廣受人們的喜愛。正因為玉米具備多項優(yōu)勢，已經(jīng)成功表達(dá)外源性基因，并取得較好的效果。1986年Fromm等首次在玉米中成功表達(dá)除草劑pat基因，經(jīng)過約十年深入研究，1995年后轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化階段。其中，抗蟲(Bt)轉(zhuǎn)基因玉米和除草劑已經(jīng)被批準(zhǔn)商業(yè)化。到了2005年，全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積超過2120萬hm2，轉(zhuǎn)基因玉米市場價值達(dá)到19.1億美元。當(dāng)然，玉米真正成為人類防治傳染病的口服疫苗，還需要進(jìn)一步探索。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種包含乙肝病毒L基因的玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法；所構(gòu)建的pCAMG-L，是一個包含1201個堿基對的閉環(huán)質(zhì)粒。將表達(dá)乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的全基因插入到植物表達(dá)載體pAMBIA1300中。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法構(gòu)建的玉米表達(dá)載體的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種包含了乙肝病毒L基因的玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)根據(jù)乙肝病毒L基因的編碼序列設(shè)計1對引物：

上游引物序列為：P1?5’-TTATCG?GGATCC?ATGGGAGGTTGGTCTTC-3’，含BamH?I酶切位點和起始密碼子；