[發明專利]一種人甲狀旁腺激素(1-34)的純化方法

有效

• 申請號: 201010138985.6
• 申請日: 2010-03-30
• 公開（公告）號: CN101798334A
• 公開（公告）日: 2010-08-11
• 發明（設計）人: 戴柱;覃亮政;馬亞平;袁建成
• 申請（專利權）人: 深圳翰宇藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K1/20
• 分類號: C07K1/20;C07K14/635
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所 44248
• 代理人: 孫偉;韓英杰

技術領域

本發明涉及一種多肽的純化方法，尤其涉及人甲狀旁腺激素(1-34)的 純化方法。

背景技術

人甲狀旁腺激素(1-34)，也稱為pTH(1-34)，是人甲狀旁腺激素 (Parathyroid?Hormone，human)氨基端的1-34個氨基酸組成的多肽。 重組人甲狀旁腺激素(1-34)[rh?pTH(1-34)]又稱特立帕肽 (teriparatide)，由美國Eli?Lilly公司研發，屬于基因重組藥物，2002 年被美國FDA批準上市。它是第1個被批準用于治療嚴重骨質疏松癥的骨 形成促進劑，有較廣泛的市場應用前景。

發明內容

本發明提出了一種純化pTH(1-34)的方法，純度高且收率好，達到產 業化要求。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案包括以下步驟：

步驟1)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以質量濃度為 0.05％-0.2％的三氟乙酸水溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B％：20％～ 40％，將粗肽溶液進行梯度洗脫；

所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未經過精 制處理的人甲狀旁腺激素(1-34)粗肽或者純度不能滿足藥用的人甲狀旁腺 激素(1-34)。“粗肽溶液”是指粗肽溶于乙腈水溶液所得到的溶液，所使 用的水為純凈水，并符合注射用水標準，優選超純水，具體的配置過程詳 見樣品處理。本發明的“乙腈”的純度級別優選色譜純。A相和B相的比 例大于20∶80，小于95∶5，A相和B相在上述比例內可以達到對粗肽 進行快速分離的目的。

步驟1)下文也表述為“純化”。

步驟2)采用反相高效液相色譜法將人甲狀旁腺激素(1-34)的三氟乙 酸鹽轉成醋酸鹽。步驟2)下文也表述為“轉鹽”。

所述“反相高效液相色譜”的固定相為八烷基硅烷鍵合硅膠，轉鹽的 方法優選為：用含3％--8％乙腈的醋酸溶液沖洗15-30min，然后用乙腈洗 脫，收集人甲狀旁腺激素(1-34)溶液；醋酸溶液的濃度為0.05％--0.2％， 優選為0.1％。洗脫步驟所采用的乙腈濃度為30-60％，優選50％。

本發明提供的純化pTH(1-34)方法操作簡單可行、純度高、收率 高，達到產業化要求。采用本發明的純化方法產品純度可達到98％以上， 收率25％。

純化規模包括以下規格色譜柱(柱子直徑×長度)：5cm×25 cm、15cm×25cm、30cm×25cm。

具體實施方式

實施例一：

1.樣品處理：將粗肽加入到超純水，加入20％乙腈，超聲使樣品完 全溶解后用濾膜過濾，收集濾液備用。

2.純化：

純化條件：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱 子直徑和長度為：5cm×25cm。流動相：A相：0.05％三氟乙酸水 溶液；B相：乙腈，流速：50-80ml/min，梯度：B％：20％～40％，檢測波 長：280nm。進樣量為1.5-3g。

純化過程：將色譜柱用50％以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量 為1.5-3g。線性梯度洗脫60min，收集目的峰，將收集的人甲狀旁腺激素 (1-34)溶液于水溫不超過35℃的條件下減壓旋蒸濃縮至約10-20mg/mL 后備用。

3.轉鹽：色譜柱：以八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子 直徑和長度為：5cm×25cm。將色譜柱用50％以上的乙腈醋酸溶液 沖洗干凈后上樣，上樣量1.5-3g，用含3％乙腈的0.05％的醋酸溶液沖洗 15-30min，然后用50％乙腈洗脫，收集目的峰，將收集的人甲狀旁腺激素 (1-34)溶液于水溫不超過35℃條件下減壓旋蒸濃縮至約150-200mg/mL 后轉至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于98％的pTH(1- 34)。

實施例二：

1.樣品處理：將粗肽加入到超純水，加入20％乙腈，超聲使樣品完 全溶解后用濾膜過濾，收集濾液備用。

2.純化：

純化條件：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱 子直徑和長度為：15cm×25cm。流動相：A相：0.1％三氟乙酸水 溶液；B相：乙腈，流速：400-450ml/min，梯度：B％：20％～40％，檢測 波長：280nm。進樣量為10-20g。