[發(fā)明專利]一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010138769.1
• 申請(qǐng)日: 2010-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101818127A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋銳;曹鴻國(guó);陶勇;章孝榮;張運(yùn)海;李運(yùn)生;殷慧群;劉亞;方富貴;劉旭光;任春環(huán);張子軍;丁建平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/076
• 分類號(hào): C12N5/076
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞分離培養(yǎng)領(lǐng)域，具體是一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

精原干細(xì)胞(Spermatogonial?stem?cells，SSCs)是生長(zhǎng)于生精小管上 皮近基底膜區(qū)域的雄性生殖干細(xì)胞，它主要參與精子發(fā)生，通過(guò)自我更新維持生 殖干細(xì)胞庫(kù)穩(wěn)定或是自我分化成一定數(shù)量的精母細(xì)胞并最終發(fā)育成精子，保證雄 性動(dòng)物正常的生殖能力。SSCs是雄性動(dòng)物中唯一能將遺傳信息傳遞給后代的干 細(xì)胞，具有很強(qiáng)的可塑性，因此它是生殖醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞工程和發(fā)育生物學(xué)、動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因等方面的重要研究材料，具有極大的科研價(jià)值。SSCs的成功分離培養(yǎng)是 對(duì)其進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)，但由于其在動(dòng)物睪丸中含量極少，不易分離純化， 給體外培養(yǎng)SSCs造成很大的困難。

目前國(guó)內(nèi)外常用的分離純化SSCs方法主要有差速貼壁法、兩步酶消化法、 Percoll密度梯度分選法、免疫磁珠分選法、免疫熒光激活細(xì)胞分選或是上述幾 種方法的結(jié)合，然而這些方法各自存在著如操作流程繁瑣、酶消化作用時(shí)間長(zhǎng)、 富集后細(xì)胞活力不高或成本較高等缺點(diǎn)。

方法一：兩步酶消化與差速貼壁結(jié)合分離富集SSCs：

(1)、離體睪丸去除白膜后，將睪丸組織轉(zhuǎn)移到離心管中，DPBS洗滌2-3 次；

(2)、加10倍體積的消化液I(含0.2％膠原酶IV的DPBS)，吸管輕輕吸打， 室溫下作用3-5min；

(3)、DPBS洗滌，離心，棄上清，重復(fù)2-3次；

(4)、加5倍體積的消化液II(分別含0.2％膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶和200μ g/ml?DNase的無(wú)血清DMEM)，吸管輕輕吸打，室溫下消化2-5min；

(5)、加10倍體積的DPBS，離心，棄上清，反復(fù)2-3次；

(6)、DPBS重懸細(xì)胞，用60μm孔徑的篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，濾出液于 1200r/5min離心，棄上清，DPBS重懸，1200r離心洗滌2次；

(7)、最后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到0.2％(w/v)明膠包被的培養(yǎng)瓶或者 6孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述接種的細(xì)胞中主要有精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞等 其他雜細(xì)胞，根據(jù)支持細(xì)胞等雜細(xì)胞貼壁快的特性，再采用差速貼壁法除去雜 細(xì)胞：a.在培養(yǎng)基中培養(yǎng)40min至1h；b.用吸管輕輕吹打，懸起生精細(xì)胞和 部分雜細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新的明膠包被的培養(yǎng)瓶/皿中，繼續(xù)培養(yǎng)3-4h；c.用同 樣的方法，再次懸起尚未緊密貼壁的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到第三個(gè)新的明膠包被的培養(yǎng) 瓶/皿中培養(yǎng)過(guò)夜至1天，直到雜細(xì)胞完全貼壁并開(kāi)始鋪展生長(zhǎng)；d.吹打懸起 精原干細(xì)胞細(xì)胞，收集并離心，棄上清，以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種至飼養(yǎng)層上 培養(yǎng)。

采用兩步酶消化與差速貼壁結(jié)合分離富集SSCs，其分離使用了膠原酶、透 明質(zhì)酸酶以及DNase或胰蛋白酶消化睪丸細(xì)胞，富集步驟持續(xù)5-6h甚至24h； 此方便操作步驟繁瑣，分離富集所需時(shí)間較長(zhǎng)；且多種消化酶對(duì)細(xì)胞的刺激和長(zhǎng) 時(shí)間懸浮可導(dǎo)致SSCs活力持續(xù)下降，使后期培養(yǎng)的SSCs生長(zhǎng)狀態(tài)較差；且分離 液中殘留紅細(xì)胞等不易貼壁雜細(xì)胞可與SSCs一起被富集培養(yǎng)，這會(huì)影響富集效 果。

方法二：兩步酶消化與Percoll密度梯度離心結(jié)合分離富集SSCs：

兩步酶消化步驟與方法一操作步驟(1)-(6)相同，但第7步在離心管中按 密度由大到小依次疊加Percoll密度梯度液，將待分離的睪丸細(xì)胞懸液置于梯度 分離液最上層，1400r/20min離心；收集27％-35％梯度之間界面上的細(xì)胞(主要 為SSCs)至離心管中。加入適量DPBS，混勻離心，棄上清再加入培養(yǎng)液，吹打 混勻后接種培養(yǎng)。

將用兩步酶消化法分離得到的睪丸細(xì)胞經(jīng)Percoll密度梯度離心富集SSCs， 這樣雖縮短了富集時(shí)間，但Percoll密度梯度離心時(shí)間就長(zhǎng)達(dá)20min，較長(zhǎng)時(shí) 間內(nèi)使用較大的離心力作用會(huì)對(duì)細(xì)胞的生物結(jié)構(gòu)造成破壞，從而對(duì)細(xì)胞活力造成 一定的影響，同樣使分離富集后的SSCs存活率不高；

方法三：采用細(xì)胞分選儀器輔助分離富集SSCs：

目前常用的儀器輔助分選方法有：免疫磁珠分選法(magnetic?activated cell?sorting，MACS)、免疫熒光激活細(xì)胞分選法(fluorescent?activated?cell sorting，F(xiàn)ACS)；