[發明專利]作為牛和豬免疫調節劑及疫苗佐劑的脫氧寡核苷酸

無效

• 申請號: 201010138162.3
• 申請日: 2010-04-02
• 公開（公告）號: CN102212524A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 鄭衛忠
• 申請（專利權）人: 于湛
• 主分類號: C12N15/117
• 分類號: C12N15/117;A61K39/39;A61P31/14
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技術領域：

本發明涉及一種脫氧寡核苷酸及其用作牛、豬免疫調節劑及疫苗佐劑的用途

背景技術：

人工合成的含有胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的寡脫氧核苷酸(CpG?oligodeoxynucleotide，CpGODN)能刺激高等動物的天然免疫系統，活化B細胞、巨噬細胞(Mφ)、樹突狀細胞(DC)及NK細胞等免疫細胞，并誘導IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ等細胞因子的分泌。CpG?ODN在作為疫苗佐劑，抵抗微生物感染及治療腫瘤等諸多方面有很高的潛在應用價值，已在人和小鼠上得到很好的驗證。

研究顯示，CpG?ODN的免疫刺激作用具有種屬特異性，即對一種動物表現表現生物活性的CpGODN，在另一種動物或人則未必表現出同樣的或同樣強度的生物活性。因此，針對每種動物的特異性的CpG?ODN仍需有目的性的研究。本發明涉及的是對牛、豬的免疫細胞均可發生激活作用的CpG?ODN，以作為豬、牛免疫調節劑及疫苗佐劑。

發明內容

為了尋找牛、豬都有作用的CpG?ODN，將其作為豬、牛的免疫調節劑及疫苗佐劑，設計了多種CpGODN，檢測了其刺激牛、豬、小鼠免疫細胞增殖的活性，并于小鼠和牛檢測了其作為口蹄疫重組蛋白疫苗佐劑的效果。結果表明，RW03(本發明所披露的CpG?ODN，其序列為：5′-tcgcgaacgttcgcccgatcgtcggta-3’)具有下述功效：

1、對牛、豬、小鼠免疫細胞具有顯著的刺激增殖作用；

2、在小鼠體內實驗中，RW03可以有效的輔助口蹄疫重組蛋白疫苗產生中和性抗體；

3、在牛體內實驗中，RW03可以有效的輔助口蹄疫重組蛋白疫苗產生中和性抗體，并保護牛使之抵抗口蹄疫病毒的攻擊。

這些功效使RW03可被用于制備牛和豬免疫調節劑及疫苗佐劑。

本發明所涉及的研究主要是：

1、RW03對牛免疫細胞免疫刺激作用的研究

我們用CpG?ODN刺激牛的脾細胞，通過³H-TdR法檢測細胞的增殖情況，在體外檢測CpG?ODN對牛免疫細胞的刺激活性。結果表明：RW03能夠有效地刺激牛脾細胞的增殖，其作用呈劑量依賴性，且刺激強度優于CpG?ODN?2006。說明RW03是一種牛敏感的CpG?ODN，可被用于制備牛的免疫調節劑及疫苗佐劑，可和牛的疫苗一起應用增強其免疫效果。

2、RW03對豬免疫細胞免疫刺激作用的研究

用CpG?ODN刺激豬外周血單個核細胞，通過³H-TdR法檢測細胞的增殖情況，在體外檢測CpG?ODN對豬免疫細胞的刺激活性。結果表明：RW03能夠有效地刺激豬脾細胞的增殖，其刺激強度與CpG?ODN2006相比無差異。說明RW03是一種豬敏感的CpG?ODN，可被用于制備豬的免疫調節劑及疫苗佐劑，可和豬的疫苗一起應用增強其免疫效果。

3、RW03對小鼠免疫細胞免疫刺激作用的研究

我們用CpG?ODN刺激小鼠脾細胞增殖實驗，通過³H-TdR法檢測細胞的增殖情況，在體外檢測CpGODN對小鼠免疫細胞的刺激活性。文獻報道，CpG?ODN?1826能顯著的刺激小鼠免疫細胞的增殖，將其作為實驗的陽性對照。結果表明：RW03能顯著地刺激小鼠脾細胞增殖，與CpG?ODN?1826相比無差別。說明RW03也是一種小鼠敏感的CpG?ODN，可以采用小鼠進行體內實驗驗證其作為豬、牛免疫調節劑及疫苗佐劑的免疫功效。

3、RW03作為口蹄疫重組蛋白疫苗的佐劑

分別將RW03與鋁或206油聯合應用，作為口蹄疫重組蛋白疫苗的佐劑免疫小鼠。利用間接ELISA方法檢測血清中中和抗體水平。結果表明：RW03與鋁或206油聯合作為口蹄疫重組蛋白疫苗的佐劑，在小鼠體內能產生高水平的口蹄疫病毒特異性抗體。

分別將RW03與鋁或206油聯合應用，作為口蹄疫重組蛋白疫苗的佐劑免疫牛。利用ELISA方法、細胞中和試驗、乳鼠中和試驗和口蹄疫病毒攻毒試驗檢測RW03的免疫增強效力。結果表明：RW03可輔助口蹄疫重組蛋白疫苗在牛體內刺激產生高水平的口蹄疫病毒中和抗體，保護牛使之抵抗口蹄疫病毒的攻擊。

發明中的術語：