[發明專利]基于生物小RNA的分子標記的方法

有效

• 申請號: 201010136826.2
• 申請日: 2010-03-30
• 公開（公告）號: CN101812520A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 樊龍江;肖炳光;桂毅杰
• 申請（專利權）人: 浙江大學;云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬生物技術與基因工程領域，涉及一種基于生物小RNA序列的分子標記新技術。 該技術適用于動植物、微生物等生物標記開發，且是一種基于PCR和基因表達序列的高通 量功能標記。

背景技術

自從Botsein等人在1980年為構建人類遺傳圖譜首次使用分子標記技術，即限制性片 段長度多態性(RFLP)以來，人們已經開發出了各種不同的分子標記來進行DNA多態性的 檢測。分子標記技術主要可分為兩大類：基于PCR技術和非基于PCR技術(如RFLP)?；? PCR技術的分子標記又可進一步分為兩類，即基于隨機引物技術(如擴增性片段長度多態性， AFLP和隨機擴增多態性DNA，RAPD)和基于目標序列的PCR技術(Agarwal?et?al.Plant?Cell Rep?2008，27：617-631)。在目標序列這一類型中，除了基于微衛星技術(如簡單序列重 復，SSR)和單核苷酸多態性(SNP)技術，基于轉座元件的分子標記也得到了很好的開發。 這種標記是根據那些大量且廣泛分布于基因組中的一小段保守序列(如LTR)來進行引物設 計的。例如，逆轉錄轉座子間長度多態性(IRAP)(Waugh?et?al.Mol?Gen?Genet?1997， 253：687-694；Kalendar?et?al.Theo?Appl?Genet?1999，98：704-711)和MITE間長度多 態性(IMP)(Chang?et?al.Theo?Appl?Genet?2001，102：773-781)。利用MITE(微反向 重復轉座因子)中逆轉錄轉座子的長末端重復(LTR)和末端反向重復(TIR)來進行引物 設計，在幾種作物(如大麥)中都得到了很好的應用。

內源性非編碼小RNA(通常21-24個核苷酸)在植物基因轉錄后調控方面發揮重要作 用?？傮w上，基于小RNA合成機理和功能(Bartel?Cell?2004，116(2)：281-297)來說， 小RNA主要可分為兩種，即微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA)。最近研究(Taft?et al.Nature?Genetics?2009，41：572-578)發現一種新類型的RNA，即轉錄起始RNA(tiRNA)， 是位于轉錄起始點上游60個核苷酸和下游120個核苷酸片段上的長度大多為18個核苷酸 的一種RNA，具有調控功能。通過高通量測序途徑可以獲得18-35個核苷酸長度的小RNA 序列。小RNA序列通常是保守的，例如miRNA，但小RNA兩翼序列多態性是很高的，很多 結構性差異(如插入或缺失)(如在水稻上，Wang?et?al.BMC?Evol?Biol，2010，in?press)。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，提供一種基于生物小RNA的分子標記的方法。為解決該 技術問題，本發明中的基于生物小RNA的分子標記的方法，包括以下步驟：

(1)小RNA序列數據的獲得

提取生物總RNA，然后根據序列長度進行分離，對其中序列長度小于35nt的RNA樣品 進行測序，以得到長度在15～35nt之間小RNA序列；

(2)小RNA序列基因組定位

將前述小RNA定位到相應基因組上，獲得每個特異小RNA在基因組定位位點的數量和 與其兩端相連序列的數據；

(3)PCR引物設計

根據在基因組中特異定位位點數量超過1000個的一批小RNA及其兩端相連序列設計 PCR引物，并通過組合獲得引物對，然后通過ePCR進行引物對的篩選；

(4)PCR擴增及其遺傳多態性檢測

根據上步獲得的引物對，進行遺傳作圖群體或遺傳多態性群體PCR擴增和多態性條帶 的確定，PCR產物的檢測通過普通變性膠或非變性膠檢測，或者通過同位素標記技術標記 方式進行檢測，以提供檢測精度和該標記開發的效率。

本發明中，步驟(1)中所述的測序是高通量測序。

本發明中，針對擴增條帶過多的情況，在引物設計中增加l～2個隨機堿基接頭。

本發明的有益效果是：