[發明專利]一種大腸桿菌和使用該大腸桿菌制備L-半胱氨酸的方法

有效

• 申請號: 201010136361.0
• 申請日: 2010-03-30
• 公開（公告）號: CN101831397A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 張建國;謝志鵬;陳聰
• 申請（專利權）人: 杭州寶晶生物化工有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/12;C12R1/19
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 陳昱彤

技術領域

本發明涉及一種大腸桿菌，以及利用大腸桿菌進行發酵制備L-半胱氨酸的方法。

背景技術

L-半胱氨酸廣泛地應用于醫藥、食品、化妝品及飼料等行業。目前L-半胱氨酸的生產主要有天然產物提取法、化學合成法、微生物轉化法和微生物發酵法。天然產物提取法采用人或動物毛發作為原料，經酸水解或堿水解法提取L-胱氨酸，再經電解還原制得L-半胱氨酸。化學合成法是利用氯代烷類化合物經過氧化反應——加成反應——還原反應——取代反應，最后得到半胱氨酸。微生物轉化法是利用DL-2-氨基-Δ²-噻唑林-4-羧酸作為前體經微生物酶轉化得到半胱氨酸。這幾種方法不僅產率低，能耗大，而且在生產過程中要用到大量的化學試劑，對環境有相當大的危害。

細菌中L-半胱氨酸的合成途徑已經被研究清楚了，L-絲氨酸在絲氨酸乙酰轉移酶(E.C：2.3.1.30)催化下，與乙酰輔酶A反應生成O-乙酰基絲氨酸，然后在O-乙酰基絲氨酸巰羥基裂解酶(E.C：2.5.1.47)催化下，形成L-半胱氨酸。

野生型大腸桿菌中，L-半胱氨酸對絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)有很強烈的反饋抑制作用(IC₅₀＝0.8μM)。有文獻報道SAT的第95位點的纈氨酸殘基被精氨酸替代，第96位點的天冬氨酸被脯氨酸替代后，L-半胱氨酸對其的反饋抑制作用會大幅度減弱(IC₅₀＝1100μM)。(IC₅₀表示SAT活性降低到50％的L-半胱氨酸的含量)。

除了對SAT的反饋抑制作用，細菌體內L-半胱氨酸的含量還受半胱氨酸脫巰基酶的調控。在大腸桿菌中目前已報導的半胱氨酸脫巰基酶有(E.C：4.1.99.1和E.C：4.4.1.8)，它們的編碼基因分別是tnaA和metC。但這兩個酶的脫巰基作用只在體外實驗中得到證明，L-半胱氨酸在細胞內代謝途徑中的作用尚不明確。

盡管已經有通過利用L-半胱氨酸對其反饋抑制作用被減弱的SAT的編碼基因以及敲除半胱氨酸脫巰基酶的表達基因的方法來制備L-半胱氨酸的技術。甚至還有人通過過量表達一種氨基酸胞外運輸蛋白編碼基因，提高L-半胱氨酸胞外運輸能力來制備L-半胱氨酸。但是目前這些生產L-半胱氨酸的技術的產量及轉化率都無法滿足工業化的需求，需要有一個更完善的L-半胱氨酸制備技術及一種更高產高效的L-半胱氨酸生產菌種。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是要提供一種大腸桿菌和使用該大腸桿菌制備L-半胱氨酸的方法，可使底物的轉化率及L-半胱氨酸的產量得到提高。

發明人經過長期和深入的研究，發現抑制谷氨酸半胱氨酸連接酶和磷酸泛酸半胱氨酸連接酶能提高大腸桿菌的L-半胱氨酸的含量，這兩個酶的編碼基因分別是gshA和dfp。并以大腸桿菌BL21(DE3)為初始菌種，通過基因工程手段對其產L-半胱氨酸能力進行定向改造，得到一種能夠生產L-半胱氨酸的菌種以及利用該菌種制備L-半胱氨酸的方法。通過增加絲氨酸乙酰轉移酶活性，降低半胱氨酸脫巰基酶活性并提高氨基酸胞外運輸能力，使大腸桿菌BL21(DE3)制備L-半胱氨酸的能力得到大幅度提高。

通過對培養基的碳源、氮源、礦物鹽及維生素、發酵時間、溫度、氫離子濃度指數等指標的研究，確定了利用上文所述菌種制備L-半胱氨酸的最佳發酵條件。

具體地說，本發明解決其技術問題所采取的技術方案是：本發明的大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQID?NO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。

進一步地，本發明所述大腸桿菌具有通過載體pET22b表達的基因bcr。

本發明使用大腸桿菌制備L-半胱氨酸的方法是：將大腸桿菌先放入種子培養基中培養，后再放入發酵培養基中得到L-半胱氨酸；所述大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQ?ID?NO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。

進一步地，本發明所述大腸桿菌具有通過載體pET22b表達的基因bcr。

進一步地，本發明所述種子培養基中含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和氯化鈉，所述發酵培養基中含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉，所述種子培養基和發酵培養基的pH值均為7。