[發明專利]DNA序列在造紙或紡織領域中的應用

無效

• 申請號: 201010136348.5
• 申請日: 2010-03-26
• 公開（公告）號: CN101818160A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 劉玉煥;李剛
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;D21C9/10;D06M16/00;C12S11/00;C12S3/08
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及多肽技術領域，具體涉及一條DNA序列在造紙或紡織領域中的應用。

背景技術

漆酶(laccase)是一類含銅的多酚氧化酶，作為一種具有重要應用潛力的工業酶制劑，漆酶能催化不同類型的底物達250多種，而且催化效率很高。

漆酶在環境保護、造紙工業、食品工業和新能源開發等諸多領域具有廣泛的應用價值。漆酶可用于生物修復和生物漂白，它可以降解應用于染料、顏料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑和殺菌劑中的氯酚類化合物和苯胺取代物，減輕環境污染。在制漿造紙工業，尤其是紙漿生物漂白方面漆酶可以脫除紙漿中的木素、改善紙漿的可漂性并提高紙漿白度。近幾年，漆酶的新功能和新用途不斷被發現和拓展，從而使漆酶具有更高的研究價值和更廣闊的應用前景。

漆酶廣泛分布于真菌和高等植物中，由于植物漆酶的檢測和純化比較困難，因此目前在工業中應用的漆酶主要來自真菌。最近，人們發現漆酶也廣泛分布于細菌中，與目前在工業生產中廣泛應用的真菌漆酶相比，細菌漆酶更容易實現高效表達，而且生產周期短，生產工藝更成熟。此外，由于大部分真菌漆酶的最適pH都是酸性或中性的，因此不適用于造紙、紡織等堿性工業環境。而細菌漆酶中不但已發現了一些具有堿性最適pH值的漆酶，而且這些漆酶通常比真菌漆酶具有更高的熱穩定性。因此細菌漆酶的研究和開發目前已成為國際上漆酶研究的一個新的熱點。

盡管細菌漆酶與真菌漆酶相比具有眾多的優勢，但由于其研究起步較晚，目前國際上已經報道的細菌漆酶并不多，而且其中僅有幾種細菌漆酶已被純化和進行了酶學特性的研究。因此目前迫切需要從自然界中發現更多新的、具有工業應用潛力的細菌漆酶，尤其是適于造紙、紡織等行業應用的堿性細菌漆酶。

宏基因組學是指直接提取環境中所有微生物的基因組DNA，將其克隆到合適的載體，構建宏基因組文庫，將環境中全部微生物的核酸信息收集在一起，并運用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得有用的酶、抗生素、活性物質等。宏基因組技術完全不依賴于環境中微生物的分離和培養，為從不同自然生境中的未培養微生物中尋找新的基因資源和活性物質提供了有力的技術手段。

應用宏基因組策略已經發現了很多具有新的酶學特性和新的用途的酶制劑，因此宏基因組技術的誕生也為發現具有新的酶學特性和工業應用潛力的細菌漆酶提供了可能。然而迄今國內尚未有利用宏基因組技術發現新的細菌漆酶的報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種來自于宏基因組的DNA序列在造紙或紡織領域中的應用。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

本發明人從廣東省深圳市的紅樹林土壤樣品所構建的宏基因組文庫中得到一條新的DNA序列，并將該序列提交GenBank，其登錄號為GQ468313，接著本發明人采用基因工程技術對該DNA序列進行功能研究，結果發現該DNA序列所表達的重組蛋白具有堿性漆酶的酶學特點，而且該重組蛋白還具有高可溶性表達的特點，因此可應用于造紙或紡織領域中。

本發明的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，該DNA序列編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。

本發明人將SEQ?ID?NO：1所示DNA序列先克隆到原核表達載體上，然后轉化大腸桿菌感受態細胞，通過對陽性轉化子的誘導表達得到重組蛋白。對該重組蛋白進行了酶學性質研究，結果如下：

(1)該重組蛋白在大腸桿菌中具有高可溶性表達的特點。在大腸桿菌感受態細胞中進行誘導表達時(30℃，OD₆₀₀＝2.4)，重組蛋白表達量最高可達380mg/L，而且重組蛋白高度可溶，無包涵體形成；

(2)該重組蛋白對幾種經典的漆酶底物均具有較強的活性。對漆酶底物2，6-DMP(2，6-二甲氧基苯酚)的酶活為12.73U/mg，對漆酶底物α-萘酚的酶活為5.43U/mg，對漆酶底物兒茶酚的酶活為7.35U/mg，對漆酶底物愈創木酚的酶活為1.02U/mg，對漆酶底物SGZ(丁香醛連氮)的酶活為0.51U/mg，對漆酶底物ABTS[2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic?acid)，2，2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]的酶活為0.15U/mg；

(3)該重組蛋白的分子量約為75kDa；

(4)該重組蛋白在對前述幾種漆酶底物進行酶解反應時，其最適反應pH均為堿性(7.4～9.0)，且在pH?7.0～10.0的范圍內保持穩定酶活，其酶活為最大酶活的80％以上；