[發明專利]昆蟲幾丁質酶基因及其dsRNA的應用

有效

• 申請號: 201010136330.5
• 申請日: 2010-03-26
• 公開（公告）號: CN101805746A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發明（設計）人: 張建珍;李大琪;張建琴;馬恩波;郭亞平;楊美玲
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/113;A01N61/00;A01P7/04
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體涉及昆蟲幾丁質酶基因序列及其dsRNA的應用。

背景技術

農業害蟲為害是我國農業產量的主要制約因素，長期施用化學殺蟲劑導致一系列問題：1)昆蟲出現抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農藥殘留導致環境污染嚴重；3)對非靶標生物有較大的影響。現有的生物殺蟲劑在害蟲防治中應用也較廣，但殺蟲時間較長，效果緩慢。

RNA干擾(RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默現象，于2006年獲得諾貝爾獎。這一發現不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為人類的疾病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年的“Nature?Biotechnology”雜志先后兩篇論文報道了施用表達靶向害蟲重要致死基因V-ATPase?A，CYP6AE14?and?GST1的dsRNA轉基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum?et?al，2007；Mao?et?al，2007)。2008年，Price?and?Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略。基于RNA干擾技術的害蟲防治具有如下優勢：1)選擇對害蟲專一的基因進行干擾，對高等動物和和人類是安全的；2)抗蟲具有專一性，對非靶標生物無殺傷作用；3)對環境無毒無害。

發明內容

本發明的目的提供一種昆蟲幾丁質酶基因及其dsRNA的在致死害蟲中的應用。

本發明提供的一種昆蟲幾丁質酶基因，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1，是通過對東亞飛蝗EST數據庫的搜索，鑒別出7條東亞飛蝗幾丁質酶基因片段，檢測了這7個幾丁質酶基因在東亞飛蝗不同組織部位的表達，篩選出在組織表皮特異表達的與東亞飛蝗蛻皮相關幾丁質酶基因LmCHT10，通過RACE-PCR擴增并進一步克隆獲得958bp的東亞飛蝗幾丁質酶基因。

本發明提供的一種昆蟲幾丁質酶基因，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：2，是根據SEQ?ID?NO：1設計上游引物SEQ?ID?NO：4和下游引物SEQ?ID?NO：5，通過PCR擴增獲得SEQ?ID?NO：2，其含有T7啟動子。進一步利用試劑盒合成dsRNA。

本發明提供的一種合成dsRNA的昆蟲幾丁質酶基因，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：3，是根據SEQ?ID?NO：1設計上游引物SEQ?ID?NO：6和下游引物SEQ?ID?NO：7，通過PCR擴增獲得SEQ?ID?NO：3，其含有T7啟動子。進一步利用試劑盒合成dsRNA。

SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA的在致死害蟲中的應用：注射上述dsRNA到昆蟲體腔，結果表明：SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA均可以特異性地沉默幾丁質酶基因LmCHT10的mRNA表達，并導致蝗蟲蛻皮困難而死亡。

附圖說明

圖1：東亞飛蝗注射SEQ?ID?NO：2或SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA后出現蛻皮困難而死亡的表型。A：2齡東亞飛蝗(左側為注射dsGFP的對照，右側為注射SEQ?ID?NO：2合成的dsRNA)；B：2齡東亞飛蝗(左側為注射dsGFP的對照，右側為注射SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA)；C：5齡東亞飛蝗(左側為注射dsGFP的對照，右側為注射SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA)。

圖2：東亞飛蝗注射SEQ?ID?NO：2或SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA后幾丁質酶基因LmCHT10的mRNA表達，β-actin做為內參基因。A：2齡東亞飛蝗(1為注射dsGFP的對照，2為注射SEQ?ID?NO：2合成的dsRNA)；B：2齡東亞飛蝗(3為注射dsGFP的對照，4為注射SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA)；C：5齡東亞飛蝗(5為注射dsGFP的對照，6為注射SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA)。

圖3：中華稻蝗注射SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA后出現蛻皮困難而死亡的表型：左側為注射dsGFP的對照，右側為注射SEQ?ID?NO：3合成的dsRNA的中華稻蝗。

具體實施方式

實施例1：東亞飛蝗幾丁質酶基因片段及其dsRNA的獲得

1、東亞飛蝗幾丁質酶基因片段的獲得

1)東亞飛蝗幾丁質酶基因在東亞飛蝗表達序列標簽EST數據庫的搜索

基于東亞飛蝗的表達序列標簽(EST)數據庫，采用生物信息學方法對東亞飛蝗幾丁質酶基因進行搜索，經過序列分析及比對后，共獲得7條幾丁質酶基因片段。