[發明專利]一種絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因及制備方法和應用

無效

• 申請號: 201010136294.2
• 申請日: 2010-03-26
• 公開（公告）號: CN101906429A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 饒曉蘭;張秀紅;呂應堂
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/10;C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于轉基因植物領域。更具體涉及一種絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因，同時還涉及一種含有絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因的制備方法，還涉及一種含有絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因在水稻中的應用。

背景技術

鈣離子作為胞內的信號分子，在植物對各種逆境信號的轉導中起著重要作用。不同逆境脅迫引發的鈣離子濃度，在變化幅度、時間及空間分布上有所不同，即產生了不同特征的所謂“鈣信號”(Ca2+?signature)。越來越多的證據說明，鈣離子是脫落酸信號傳導途徑中的第二信使。植物脫落酸應答時，保衛細胞中的鈣離子濃度出現升高和降低的反復振蕩，進而引發了氣孔關閉等一系列下游應答反應(Allen?et?al，2001)。植物中有一類蛋白稱為鈣感受蛋白，能接受鈣離子信號的變化，從而傳遞信號，引起各種生理效應。這類蛋白包括鈣調素(CaM)、鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)和CBL蛋白(calcineurinB-like?protein，CBL)。CBL蛋白雖然能結合鈣信號，但自身并沒有激酶結構域，必須和其他靶蛋白作用來調節下游級聯反應。利用酵母雙雜交技術鑒定出CBL的靶蛋白是一類蛋白激酶家族成員，命名為CIPK。這類蛋白激酶家族與SNF1/AMPK家族在激酶域上是相關的，屬于Ser/Thr蛋白激酶。目前研究發現，在擬南芥中CIPK基因家族有25個成員，而水稻中有30個成員(Batistic，O?and?Kudla，J.Integration?and?channeling?ofcalcium?signaling?through?the?CBL?calcium?sensor/CIPK?protein?kinase?network.Planta.2004，219：915-924)。本發明中分離出一個水稻中新的CIPK家族成員，該基因抑制表達轉基因植株在水稻幼苗時期表現為耐鹽，為水稻抗逆品系的篩選和獲得提供了一種新的方法。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因，已有的研究發現，該基因所在家族參與了植物抗逆調控(Batistic，O?and?Kudla，J.Integrationand?channeling?of?calcium?signaling?through?the?CBL?calcium?sensor/CIPK?proteinkinase?network.Planta.2004，219：915-924)，該轉基因植株表現為幼苗時期在高濃度鹽培養基中有較高的發芽率，能提高水稻在高鹽脅迫下的抗逆性。

本發明的另一個目的是在于提供了一種絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因的制備方法，該方法易行，操作簡化，簡化了水稻抑制表達轉基因植株。

本發明的再一個目的是在于提供了一種絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因在水稻萌發時抗鹽中的應用，能有效地提高了水稻抗逆性，其轉基因植株在高鹽條件下芽發率較高。

一種含有絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因的制備方法，包括以下步驟：

A.提取水稻幼苗RNA，并通過RT-PCR反轉錄得到含有水稻cDNA文庫，利用設計的引物CACCCAGCCAACCTTGATGAATG(SEQ?ID?NO：1)和CTCATATCCTCAGCCGCATC(SEQ?ID?NO：2)從A步中得到的水稻幼苗cDNA文庫里擴增得到一個蛋白激酶基因克隆，片斷長度為400bp(SEQ?ID?NO：3)。

B.將A步獲得的基因片斷連接到中間載體pENTRTM/D-TOPO(購自Invitrogen公司)中，得到中間載體質粒。

C.將B步獲得的質粒利用重組LR反應，連入水稻抑制表達載體pANDA(Miki，D.，Shimamoto，K.Simple?RNAi?vectors?for?stable?and?transientsuppression?of?gene?function?in?rice.Plant?Cell?Physiol.2004，45：490-5)中，形成可轉化的表達質粒載體。

D.D、將C步獲得的質粒轉入農桿菌EHA105(來自中國典型培養物保藏中心)，導入成熟胚誘導的水稻愈傷組織中，得到農桿菌感染的水稻愈傷，以備進一步分化成植株。