[發明專利]抗牙齦卟啉單胞菌卵黃免疫球蛋白疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201010135959.8
• 申請日: 2010-03-25
• 公開（公告）號: CN101791405A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 徐燕;沈繼龍;姜大川;羅慶禮
• 申請（專利權）人: 安徽醫科大學
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;A61K39/02;A61P31/04;A61P1/02;C07K16/02
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術領域

本發明屬于一種生物制劑的制備方法，具體涉及抗牙齦卟啉單胞菌卵黃免疫球蛋白疫 苗的制備方法。

背景技術

慢性牙周炎是最為常見的口腔疾患之一，不僅是導致人類失牙的主要因素之一，還是 一些系統疾病的危險因素。有報告稱牙周炎患者發生冠心病和中風的幾率分別為牙周正常 者的1.4倍和2.1倍；牙周炎會增加呼吸道病原菌在患者咽部的定植，發生慢性肺部感染 及肺功能降低的幾率是口腔衛生良好者的2倍；患重癥牙周炎的孕婦，發生早產和低體重 兒的危險性是牙周正常孕婦的7.5倍；糖尿病患者中慢性牙周炎發病率明顯增高；急性或 亞急性感染性心內膜炎患者中有30％與牙源性感染有關；細菌產生大量的內毒素并進入血 液，可誘發或加重動脈粥樣硬化，引發心瓣膜炎甚至缺血性心臟病。究其原因，可能是慢 性牙周炎累及多個牙，感染的面積大，創口開放，細菌及產生的毒素隨血液循環系統進入 并定植在其他器官，引起的病變；同時因患牙松動，咀嚼時將牙向根尖部壓迫而將微生物 及毒素擠壓到血管和淋巴管中，使得牙周組織中的細菌持續性感染刺激宿主的免疫反應。 革蘭陰性厭氧菌---牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas?gingivalis，Pg)以及其他革蘭陰性 厭氧菌是慢性牙周炎病變區及活動部位的主要優勢致病菌，是公認的慢性牙周炎優勢致 病菌之一，與牙周炎的發生、治療后復發或病情加重密切相關。

目前，牙周炎的治療主要包括基礎治療、藥物治療和牙周手術等。常規的潔治、刮治 和翻瓣術只能暫時控制菌斑，消除炎癥，阻止病變加重，在中度牙周炎治療中有較好的效 果。但重度牙周炎由于其牙周袋結構的復雜性導致刮治器械進入困難、難以徹底清除齦下 致病菌。齦下刮治術對于醫師的臨床操作要求較高，醫師必須經過系統性的長期培訓后才 能有效的清楚菌斑，消除炎癥。這對基層醫院和基層醫師在相當長的一段時期內還是需要 解決的難點。在慢性牙周炎外用治療藥物中，主要是防腐劑和抗菌緩釋劑，如氯已定含漱 液和鹽酸米諾環素軟膏，但是此類藥容易產生細菌耐藥和毒副作用，不宜長期使用。日本 學者Yokoyama等[1]用純化后的牙齦素免疫母雞，結果發現抗牙齦素的卵黃免疫球蛋白 (IgY)可明顯抑制牙齦素對人類上皮細胞的降解，阻止細胞基質的破壞；進一步的臨床 研究顯示卵黃免疫球蛋白(IgY)軟膏有助于潔刮治和根面平整后的臨床癥狀改善和減少 牙齦卟啉單胞菌的數量[2]。Hamajima[3]使用抗重組的40kDa的牙齦卟啉單胞菌381外膜 蛋白的卵黃免疫球蛋白能有效抑制Pg菌在口腔細菌上的共聚集。但是，采用特異性卵黃 免疫球蛋白生物制劑治療慢性牙周炎在國內尚未見到相關研究和有關產品報道。對穿入組 織內的致病菌而言，單純的基礎治療難以完全殺滅，往往輔助抗生素治療。然而，抗生素 頻繁給藥極易造成細菌耐藥，且具有毒副作用。

卵黃免疫球蛋白(immunoglobulin?of?yolk，IgY)是雞蛋卵黃中的多克隆抗體，具有 耐熱、耐酸堿、制備成本低，易于商品化等突出優點。

發明內容

為了尋找一條有效安全的治療慢性牙周炎的途徑，本發明提供一種抗牙齦卟啉單胞菌 卵黃免疫球蛋白疫苗的制備方法。

本發明利用牙齦卟啉單胞菌制成抗原免疫良種雞，從其所產蛋中制備出抗牙齦卟啉單 胞菌卵黃免疫球蛋白(抗Pg-IgY)，研發高效無毒，易于標準化制備的卵黃免疫球蛋白牙 周袋生物疫苗制劑，依托工業化生產，試圖開辟生物抗體防治牙周炎的新途徑。

本發明抗牙齦卟啉單胞菌卵黃免疫球蛋白疫苗的制備方法包括以下操作步驟：

(1)牙齦卟啉單胞菌的培養和鑒定

用牙齦卟啉單胞菌國際標準菌株培養分離取得牙齦卟啉單胞菌備用；

(2)獲取牙齦卟啉單胞菌菌體蛋白

將分離出的牙齦卟啉單胞菌在牛腦心浸液(BHI)羊血液體培養基中37℃，80％氮氣(N₂)、 10％二氧化碳(CO₂)、10％氫氣(H₂)增菌厭氧培養48h，收集細菌，超聲震碎至90％細胞完 全破碎，4000r/min×10min離心，收集上清液，即為牙齦卟啉單胞菌全菌可溶性蛋白抗 原，溫度4℃保存備用；

(3)蛋雞免疫