[發明專利]利用HRM技術在非細胞體系中進行基因突變檢測的方法

無效

• 申請號: 201010134227.7
• 申請日: 2010-03-29
• 公開（公告）號: CN101955990A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 王弢;秦勇;陳菲;時凱
• 申請（專利權）人: 蘇州工業園區為真生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

1.一種利用HRM技術在非細胞體系中進行基因突變檢測的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

(1)設計并選取含有目的基因的靶向區域中至少15個連續的核苷酸構成連續核苷酸序列的若干個引物對；

(2)從非細胞體系中提取DNA，利用若干個預先篩選的引物對對目的基因靶向序列進行特異性擴增；

(3)根據高分辨率熔解曲線法對擴增后的基因序列進行突變位點檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述非細胞體系選自外周血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔道的脫落物、病變新鮮組織、冰凍病變切片、石蠟病變切片。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因選自EGFR、KRAS、BRAF、C-KIT、P13K和PDGFRA。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述特異性擴增在PCR反應體系中進行，所述PCR反應成分包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA和水，所述PCR反應體系終濃度組成為：

PCR緩沖液????????????終濃度1～10×；

dNTPs????????????????0.1～1mM；

引物序列?????????????終濃度為0.1～1μM；

模板DNA??????????????0.05～2ng/μL；

TaqDNA聚合酶?????????0.01～0.10U/μL；

MgCl₂????????????????終濃度為1～5mM；

熒光染料?????????????1～3×。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR反應體系終濃度組成為：

PCR緩沖液????????????終濃度1～5×；

dNTPs????????????????0.1～0.5mM；

引物序列?????????????終濃度為0.1～0.5μM；

模板DNA??????????????0.05～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶???????????0.01～0.10U/μL；

MgCl₂??????????????????終濃度為1～3mM；

熒光染料???????????????1～2×。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述熒光染料選自DNA飽和性染料包括EvaGreen染料、LCPLUS染料、ResoLight染料、SYTO?9染料；所述dNTP混合液包括10mM?dATP、10mM?dCTP、10mMdTTP、10mM?dGTP的混合液；所述PCR緩沖液包括Tris·cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；-20℃下pH值在8.0-9.0間。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于進行PCR擴增反應的條件為92～97℃預變性4～15min；92～97℃變性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，35-55個循環。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述高分辨率熔解曲線法的條件為：92～97℃變性1分鐘；40℃復性1分鐘；然后初始熔解溫度60～65℃開始程序升溫熔解至95℃，并在熔解過程中實時檢測熒光信號，30～50次每秒。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中為集成程序化方法，進行PCR擴增反應的條件為95℃預變性5min；95℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50個循環；所述高分辨率熔解曲線法的條件為：95℃變性1分鐘；40℃復性1分鐘；然后初始熔解溫度65℃開始程序升溫熔解至95℃，并在熔解過程中實時檢測熒光信號，40次每秒。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述從非細胞體系中提取DNA選自使用QIAGEN?Blood?Mini?kitt試劑盒或TIANGEN?Blood?Mini?kit試劑盒提取或使用傳統酚氯仿法提取。