[發明專利]編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因及其應用

無效

• 申請號: 201010133516.5
• 申請日: 2010-03-25
• 公開（公告）號: CN101831443A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 金蕪軍;林敏;宛煜嵩;李海紅
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張慶敏

技術領域

本發明涉及微生物基因工程領域，特別是涉及一個草甘膦抗性編碼基因的克隆與應用。

背景技術

在農業生產中，要定期除掉田間雜草以免它們跟農作物爭奪肥料。與手工除草相比，噴灑除草劑可以減小勞動強度，降低勞動成本，提高糧食產量。除草劑有很多種，毒性有強有弱，針對性也不同。草甘膦是一種比較溫和、對環境破壞性很低的除草劑，但是它在殺死雜草的同時，也對作物有破壞作用，影響作物的生長。農民為了能夠有針對性地除去雜草，往往要用好幾種毒性較強的除草劑。給農作物轉入草甘膦抗性基因，讓作物體內在這個基因的指導下生產出能抵抗草甘膦的破壞作用的某種酶，作物即使吸入了草甘膦也能繼續生長。因此，種植了抗除草劑轉基因作物后，農民只要施加一兩次溫和的草甘膦，就可除去野草，又不損害農作物，而不必采用多次施加各種較有針對性但是毒性較強的除草劑。

一直以來，從自然界中尋找對草甘膦具有良好抗性的基因是我們的研究重點。各國科學家已經從根癌農桿菌(A.tumefaciens?sp.strainCP4)、無色桿菌(A.sp.strain?LBAA)、假單胞菌(P.sp.strain?PG2982)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)等菌株中克隆了對草甘膦不敏感的EPSPS基因。這些基因在農作物中的過量表達，可以提高植物對草甘膦類除草劑的抗性。此外，通過突變EPSPS的某些位點的氨基酸，可以降低EPSPS對草甘膦的親和性，提高基因的草甘膦耐受性。

20世紀80年代以來，美國Monsanto和Calegene等公司獲得轉基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉基因作物已進入商品化生產。但大面積商業化應用的主要是Monsanto公司的CP4?EPSPS基因。目前，培育能夠穩定遺傳，并保證作物產量、質量的抗草甘膦作物仍是研究的重點。

發明內容

本發明的目的是提供一種編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，其具有優良的草甘膦抗性。

一種編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，其中所述EPSPS具有如SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列，或該序列經改變、添加和/或缺失一個或多個核苷酸且具有相同功能的氨基酸序列。本發明的基因，其具有如SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。本發明的基因是從新疆納拉提草原周邊采集的土樣中分離獲得的一株人蒼白桿菌中通過同源克隆的方法從該菌株中克隆得到的。通過草甘膦抗性實驗，發現該基因具有良好的草甘膦抗性，可以耐受200mM草甘膦濃度，是同類基因中的優秀者。通過與經典的一型和二型合酶進行同源性比對發現，該基因與二型合酶相似性更高。通過進一步的分析發現，二型合酶中與草甘膦耐受有關的保守序列GDKS，SAQVK，NPTR，和RDHTE均在野生型的P23EPSPS中存在。通過將此基因連接到原核表達載體上并轉入EPSPS合酶缺陷的大腸桿菌中發現，該基因可以互補EPSPS缺陷，使缺陷菌株恢復在M9限制性培養基上生長的功能。

應當理解，考慮到密碼子的簡并性和用于具體表達的植物或微生物的優選密碼子，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響基因表達的條件下，對SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列進行修改。因此，本發明還包含對SEQ?ID?No.1所示序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與本發明基因相同功能的核苷酸序列。

進一步地，本發明提供所述基因的克隆載體或表達載體，以及其轉化宿主。其宿主可以為原核細胞、植物細胞、植物組織等等，其中的原核轉化宿主細胞，可耐受300mmol以下的草甘膦。

本發明還提供一種5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，其具有如SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列，并且，本發明還包括對表達自本發明基因的蛋白質(SEQ?ID?No.2)進行各種取代、添加和/或缺失一個或多個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發明提供的基因和表達載體可用于轉化農作物，達到植物耐受除草劑的目的。

附圖說明

圖1為實施例1中aroA_P23PCR擴增結果，其中1：DL2000Marker，2：aroA_P23；

圖2為實施例4中aroA_P23互補實驗結果，其中1：ER2799，2：ER-pUC18，3：ER-pUCP23；