[發(fā)明專利]一種治療乙型肝炎的重組質(zhì)粒DNA疫苗

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010132643.3
• 申請日: 2010-03-26
• 公開（公告）號: CN102198275A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鼎峰;劉勇;周德勝;張春麗
• 申請（專利權(quán)）人: 北京凱因科技股份有限公司;北京凱因生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/29;A61P31/20;A61P1/16;C12N15/34
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種治療乙肝疾病的重組質(zhì)粒DNA疫苗，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乙型肝炎嚴(yán)重危害人類健康，目前尚無特效治療手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后機(jī)體缺乏持久的特異性細(xì)胞免疫及體液免疫。HBV外殼蛋白是有大蛋白LS(S1S2S抗原，由前S1-前S2-S基因編碼)、中蛋白MS(S2S抗原，由前S2-S基因編碼)、小蛋白S(S抗原，由S基因編碼)三種分子構(gòu)成，其中，前S2抗原分子量小，抗原性強(qiáng)，涉及乙肝病毒對宿主細(xì)胞的吸附，因而含前S抗原的疫苗最被接種者的保護(hù)作用應(yīng)更為有效，在HBV感染后的病毒清除方面發(fā)揮重要作用。

重組質(zhì)粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表達(dá)載體上，然后將重組質(zhì)粒直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。與傳統(tǒng)的疫苗相比，重組質(zhì)粒DNA疫苗不僅能有效誘導(dǎo)體液免疫，還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，DNA質(zhì)粒疫苗(基因疫苗)已經(jīng)在許多疾病的治療和預(yù)防方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在乙型肝炎病毒DNA疫苗的構(gòu)建和免疫效果方面進(jìn)行了大量的研究，由于載體大小不同以及載體DNA結(jié)構(gòu)中，有無免疫刺激序列均會影響DNA疫苗引發(fā)的免疫效果。在現(xiàn)階段的研究中，構(gòu)建的乙型肝炎病毒DNA疫苗所用的質(zhì)粒所用的載體中大都缺乏免疫增強(qiáng)的成分，如所用的載體pcDNA3.1、pVAX1、pHBVα等，載體分子量較小，缺乏免疫刺激序列，當(dāng)用這些載體構(gòu)建的重組DNA疫苗對人體進(jìn)行免疫治療時，所起得的免疫治療效果也相對較低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新的治療乙肝的重組質(zhì)粒DNA疫苗，本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒DNA疫苗在傳統(tǒng)DNA疫苗載體基礎(chǔ)上加入了一些提高外源抗原蛋白表達(dá)及刺激機(jī)體免疫反應(yīng)的功能元件，在動物實(shí)驗(yàn)免疫時，可獲得更好的細(xì)胞免疫和體液免疫效果。

具體地，本發(fā)明所述的治療乙肝的重組質(zhì)粒DNA疫苗攜帶乙肝病毒(HBV)蛋白編碼基因，并含有大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)ColE1、卡那抗性基因序列Kan、來源于SV40的增強(qiáng)子元件Enhancer、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件內(nèi)含子Intron1和外顯子Exon1、來源于HBV的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件HPRE及免疫調(diào)節(jié)序列CpG等元件，其中乙肝病毒蛋白基因受增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件Intron1和Exon1及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件HPRE和牛生長激素基因的聚腺苷酸信號調(diào)控。

本發(fā)明中，所述的重組質(zhì)粒DNA疫苗還可攜帶有多克隆位點(diǎn)區(qū)MCS，所述的多克隆位點(diǎn)區(qū)包括SwaI、KpnI、SaII、EcoRv、BgIII等酶切位點(diǎn)。

本發(fā)明中，質(zhì)粒中所含的HBV蛋白編碼基因可以是S1S2S或S2S或S蛋白編碼基因中的任意一種，優(yōu)選HBV包膜中S2S蛋白編碼基因。

本發(fā)明中S2S編碼基因可以是HBV蛋白中的B亞型的preS2S編碼基因，也可以是C亞型的preS2S編碼基因，優(yōu)選C亞型的preS2S編碼基因。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種構(gòu)建本發(fā)明所述的重組疫苗質(zhì)粒的方法，具體包括：

(1)先構(gòu)建重組質(zhì)粒載體骨架pOE-EKS，其核苷酸序列為Seq?No.1所標(biāo)示的核苷酸序列：

以pDRVISV1.0為模板，以Primer1與Primer2為引物，其中引物2為5’末端磷酸化的引物，擴(kuò)增獲得大小為748bp的復(fù)制子區(qū)域(Ori)，同時引入EcoRI、KpnI及SwaI酶切位點(diǎn)；

Primer1：5’-GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’

Primer2：5’-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’

以pDRVISV1.0為模板，以Primer3與Primer4為引物，其中引物3為5’末端磷酸化的引物，擴(kuò)增獲得大小為1056bp的卡那抗性標(biāo)記基因(Kan)，同時引入EcoRI酶切位點(diǎn)，

Primer3：5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’

Primer4：5’-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’

將上述兩個片段分別以EcoRI進(jìn)行單酶切，連接后構(gòu)建重組克隆pOK-EKS；

(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA疫苗pRec2.0-cPreS2.S