[發明專利]利用埃希桿菌屬細菌生產L-氨基酸的方法

有效

• 申請號: 201010132502.1
• 申請日: 2002-11-21
• 公開（公告）號: CN101838628A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: V·A·里斯特斯;M·V·維圖斯基納;S·V·馬斯科;V·G·多羅森科;I·V·比尤科瓦;Z·I·卡塔斯基納;A·Y·斯科羅霍多瓦;A·V·貝拉雷瓦
• 申請（專利權）人: 味之素株式會社
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12P13/22;C07K5/075
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 孔青;付磊

本申請為分案申請，原申請的申請日為2002年11月21日，申請號為02827470.9(PCT/JP02/12203)，發明名稱為“利用埃希桿菌屬細菌生產L-氨基酸的方法”。

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及發酵生產某些氨基酸，即芳香族酸，例如L-苯丙氨酸和L-色氨酸的方法，更具體地涉及來源于大腸桿菌的一個基因。該基因能提高L-苯丙氨酸和L-色氨酸的生產效率。

背景技術

傳統上，利用天然來源微生物菌株或對該微生物菌株特別修飾以提高L-氨基酸生產效率的突變株進行發酵，來實現L-氨基酸的工業生產。

現已公開了許多提高L-氨基酸生產效率的技術，例如用重組DNA轉化微生物(參見：美國專利4,278,765)。這些技術建立在提高參與氨基酸生物合成的酶活性和/或降低對生成的氨基酸起反饋抑制作用的靶標酶敏感性的基礎之上(參見：日本專利申請No?56-18596(1981)，WO?95/16042或美國專利5,661,012和6,040,160)。

另一方面，增加氨基酸的分泌活性也可以提高L-氨基酸產生株的生產效率。已經公開了一種屬于棒狀桿菌屬的賴氨酸產生株，其賴氨酸分泌基因(lysE基因)的表達增加(WO?9723597A2)。此外，編碼用于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或噻唑烷衍生物分泌的外泌蛋白的基因也已被公開(美國專利5,972,663)。

目前，已公開了大腸桿菌中幾個能增加L-氨基酸產量、編碼產物推定為膜蛋白質的基因。rhtB基因的額外拷貝使細菌對L-高絲氨酸的耐受增加并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的產量(歐洲專利申請EP994190A2)。rhtC基因的額外拷貝使細菌對L-高絲氨酸、L-蘇氨酸更具耐受力，并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸和L-亮氨酸的產量(歐洲專利申請EP1013765A1)。yahN、yeaS、yfiK和yggA基因的額外拷貝能提高L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的產量(歐洲專利申請EP?1016710A2)。

在本發明人早期曾獲得了一個突變株大腸桿菌K-12，該突變株具有突變的thrR基因(在這里被稱作rhtA23)，該突變與該菌株對基礎培養基中高濃度的蘇氨酸和高絲氨酸的耐受性有關(Astaurova，O.B.etal.，Appl.Biochem.Microbiol.，21，611-616，1985)。對于不同的大腸桿菌生產株系，突變分別提高了L-蘇氨酸(SU974817)、高絲氨酸和谷氨酸鹽(Astaurova，O.B.et?al.，Appl.Biochem.Microbiol.，27，556-561，1991)的產量。

另外，本發明人發現rhtA基因位于大腸桿菌染色體的第18微小體(min)處，鄰近編碼谷氨酰胺轉運體系組分的glnHPQ操縱子，而且與pexB基因和ompX基因之間的ybiF開放式閱讀框一致。表達這個開放式閱讀框編碼的蛋白質的DNA單位定名為rhtA基因(rht：高絲氨酸和蘇氨酸耐受)。

此外，本發明人發現rhtA基因擴增也會增加細菌對高絲氨酸、蘇氨酸的耐受性。rhtA23突變將在其ATG起始密碼子-1位上的A替換為G(1997年8月24-29號在加利福尼亞舊金山市召開的第17屆國際生物化學和分子生物學大會及1997年美國生物化學和分子生物學界年會論文摘要第457號)。已知起始密碼子和SD序列的間隔區核苷酸組成、尤其是起始密碼子即上游的序列極大的影響mRNA的翻譯能力。現已發現起始密碼子前三位的核苷酸的差異可造成基因表達水平相差20倍(Gold?et?al.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-4031981；Hui?et?al.，EMBO?J.，3，623-629，1984)。因此，rhtA23突變可增加rhtA的基因表達。