[發明專利]特異性結合EPO的DNA適配體、其制備方法及其用途

有效

• 申請號: 201010131512.3
• 申請日: 2010-03-19
• 公開（公告）號: CN102191250A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 謝劍煒;張朝陽;郭磊;唐吉軍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68;G01N33/68;C40B30/04
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

1.特異性結合EPO蛋白的適配體，其選自SEQ?ID?NO：1～120所示的序列中的一個或者多個。

2.根據權利要求1所述的適配體，其選自SEQ?ID?NO：53、56、60、113、116和120所示的序列。

3.根據權利要求1-2所述的任一項適配體，其被能夠增強其半衰期、提高其穩定性、防止核酸內切酶或者外切酶切割的化合物所修飾。

4.用于EPO蛋白檢測的組合物、試劑盒和芯片，其中含有權利要求1-3中任一項的適配體。

5.根據權利要求4所述的適配體，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種。

6.權利要求1-3中任一項的適配體用于EPO蛋白檢測的用途。

7.根據權利要求6所述的適配體，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種。

8.篩選特異性結合EPO蛋白的適配體的方法，包括步驟(a)-(1)：

(a)提供下述(i)-(iv)：

(i)篩選文庫：ssDNA文庫；

(ii)靶蛋白：EPO蛋白，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHUEPO-α蛋白、rHUEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種，優選rHUEPO-α蛋白；

(iii)親和樹脂：偶聯有對EPO有特異性親和力的物質的樹脂，優選偶聯有麥胚凝集素的瓊脂糖樹脂；和

(iv)偶聯有EPO的親和樹脂(iii)；

(b)使步驟(a)中的篩選文庫和親和樹脂(iii)在適宜的條件下接觸，

所述接觸可以包括溫育、洗滌，

所述“適宜的條件”是指足以使篩選文庫中的成員能夠和親和樹脂特異性結合的結合的條件，該條件可以涉及溫度、作用時間、結合緩沖液的成分、pH值；

然后收集未與親和樹脂(iii)結合的ssDNA文庫；

(c)使步驟(b)中未與親和樹脂(iii)結合的ssDNA文庫和親和樹脂(iv)在適宜的條件下接觸，

所述接觸可以包括溫育、洗滌，

所述“適宜的條件”是指足以使篩選文庫中的成員能夠和親和樹脂特異性結合的結合的條件，該條件可以涉及溫度、作用時間、結合緩沖液的成分、pH值；

(d)收集經步驟(c)處理的與親和樹脂(iv)結合的文庫成員；

(e)任選地對步驟(d)的文庫成員進行擴增處理；

(f)將步驟(d)或者(e)中的文庫成員與步驟(a)中的(iv)在適宜的條件下接觸，所述“適宜的條件”是指足以使步驟(d)或者(e)中的文庫成員能夠和EPO特異性結合的條件；

(g)任選地，在步驟(f)中進行條件嚴格化處理，所述處理選自減少靶蛋白EPO的用量、在接觸步驟后增加洗滌步驟和在接觸步驟中加入非競爭性抑制劑tRNA中的一種或者多種；

(h)收集在步驟(f)或(g)中與(iv)特異性結合的文庫成員；

(j)重復步驟(e)-(h)，重復次數為1、2、3、4、5、6、7、8次，優選重復6-8次，更優選重復8次；

(k)對(g)步驟獲得的文庫成員進行確認，優選序列測定；和

(l)任選地，對獲得的文庫成員進行功能檢測，優選電泳遷移率變動分析(EMSA)。

9.根據權利要求7所述的篩選方法，其中適宜的條件是指溫育溫度為37℃，作用時間為1h，篩選液的1×儲液配方為：20mM?Tris-HCl、140mM?NaCl、5mM?MgCl₂、5mM?KCl，其中Mg²⁺的工作濃度保持在0.1-50mM，優選Mg²⁺的工作濃度為0.1、5、10、20、50mM，最優選5mM。

10.根據權利要求1和8所述的適配體，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種。