[發(fā)明專利]創(chuàng)傷弧菌核酸定量檢測試紙條

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010131211.0
• 申請日: 2010-03-04
• 公開（公告）號: CN101818200A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范建忠;范翠翠;黃寶福;宋超霞;游玉容
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波博奧生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)換磷光(UPT)核酸層析技術(shù)的水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌基因診斷定量檢測試紙條，特別涉及對創(chuàng)傷弧菌特定基因片段具有特異性的引物及探針；還涉及將上述引物及探針用PCR擴(kuò)增法檢測水產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的上轉(zhuǎn)換磷光核酸層析檢測方法和檢測試劑盒。該檢測方法用以靈敏、快速、定量檢測水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌。

背景技術(shù)

創(chuàng)傷弧菌是海洋和鹽湖中廣泛分布的一種嗜鹽性病原菌，該菌對于糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、肝炎及原因不明的肝功能障礙，艾滋病或其它重病患者的危害相當(dāng)嚴(yán)重，特別是對原發(fā)性敗血癥病例，死亡率超過50％。目前世界上大部分沿海國家都有創(chuàng)傷孤菌感染的病例報告。創(chuàng)傷弧菌的感染途徑有兩個：一是經(jīng)口感染，引起原發(fā)性敗血癥，這主要是由于食用生的或未經(jīng)充分加工的貝類引起的；二是通過皮膚傷口侵入，在原皮膚傷口處形成紅腫、紅斑和劇烈疼痛，發(fā)展迅速，最終引起敗血癥，這主要是由于傷口接觸存在創(chuàng)傷弧菌的貝類或海水引起的。歐盟已要求對從我國進(jìn)口的水產(chǎn)品檢測創(chuàng)傷弧菌，因此，開展水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的污染情況調(diào)查，研究快速檢測和分離創(chuàng)傷弧菌的方法顯得尤為重要。

創(chuàng)傷弧菌傳統(tǒng)的檢測方法是通過首先使用創(chuàng)傷弧菌增菌培養(yǎng)基堿性蛋白胨水(APW)或添加多粘菌素B的APW增菌12～16h，改良纖維二糖多粘菌素B多粘菌素E瓊脂或纖維二糖多粘菌素E瓊脂劃線培養(yǎng)18h～24h，挑取可疑菌落以3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂接種，挑菌后進(jìn)行生化實驗，或選用API?20E診斷試劑條。傳統(tǒng)方法經(jīng)過多個篩選步驟，需要多種培養(yǎng)基，耗時較長；另有利用vvh單克隆抗體檢測的方法，該方法要求挑取單一的菌落大量增菌后利用免疫學(xué)方法鑒定，特異性較高，但兩種方法檢測所需時間均較長，為了盡量減少人類因接觸或食用創(chuàng)傷弧菌污染的水產(chǎn)品，建立靈敏、特異的檢測方法對保護(hù)人類健康極為重要。

創(chuàng)傷弧菌基因檢測技術(shù)為病原菌的快速檢測提供了有力的工具，也是未來創(chuàng)傷弧菌檢測方法研究的一個重點。本發(fā)明將創(chuàng)傷弧菌基因檢測技術(shù)與核酸擴(kuò)增產(chǎn)物層析檢測法相結(jié)合，建立了快速、靈敏度高的創(chuàng)傷弧菌基因診斷定量檢測試紙條。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的在于，提供一種對創(chuàng)傷弧菌特定基因片段具有特異性的引物。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

一種創(chuàng)傷弧菌檢測用引物，其特征在于，能擴(kuò)增靶基因特異性堿基序列，所述靶基因為創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA。所述引物與vvhA的350位～800位的核苷酸的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。

所述引物由下列引物組成：

正向引物vvhA1：ccgcacttacattggtcc

反向引物vvhA2：tagggttgaacttcgtctta

特別地，vvhA1正向引物或vvhA2反向引物以生物素或地高辛標(biāo)記，可以擴(kuò)增vvhA的350位～800位的核苷酸。

為增加反應(yīng)的特異性，本發(fā)明還提供一條探針，此探針與vvhA的350位～800位的核苷酸的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)，該探針的序列為：

vvp：gccgtctttgttcacttccgc

并且，該探針標(biāo)記了FITC。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物和探針基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測創(chuàng)傷弧菌的檢測方法及檢測試劑盒。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種創(chuàng)傷弧菌的檢測方法：該方法用于檢測水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌，其特征在于，以創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA350位～800位的核苷酸的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)為靶，通過PCR法用上述引物選擇性擴(kuò)增上述靶區(qū)域，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物本實驗選取了快速定量檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測試紙條，包括由樣品吸收區(qū)、結(jié)果掃描窗和終點指示窗構(gòu)成的檢測試紙和反應(yīng)緩沖液，快速定量檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物試紙條分為底板、玻璃纖維層、抗體吸附膜及吸水紙，快速定量檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法包括包被標(biāo)記物抗體、核酸擴(kuò)增標(biāo)記上轉(zhuǎn)磷光檢測。

試紙由樣品墊、抗體吸附膜、吸水紙、粘性底襯、試紙條外殼組成，其中生物素或地高辛抗體吸附于抗體吸附膜，樣品經(jīng)上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記試劑標(biāo)記，過程包括標(biāo)記生物素或地高辛特異性引物擴(kuò)增，標(biāo)記FITC特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，上轉(zhuǎn)磷光顆粒標(biāo)記FITC抗體特異性結(jié)合FITC，加樣于加樣區(qū)，標(biāo)記實驗結(jié)果由UPT生物傳感器分析判讀。

具體檢測方法為：

(1)樣品處理和模板提取