[發(fā)明專利]人表皮生長因子受體外顯子19及21突變檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010131040.1
• 申請日: 2010-03-24
• 公開（公告）號: CN102199657A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 溫劍平;孫延波;李菁華;史紅艷
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種應(yīng)用PCR技術(shù)檢測人基因組表皮生長因子受體(EGFR)外顯子19、21突變的檢測試劑盒。

背景技術(shù)

肺癌目前是世界范圍內(nèi)發(fā)生率和死亡率第一的惡性腫瘤，雖經(jīng)多年努力，總的治療效果仍不樂觀。進入二十一世紀以來，以表皮生長因子受體(Epidermal?growth?factor?receptor，EGFR)為靶標的分子靶向藥物的出現(xiàn)為肺癌的治療帶來了新的希望和手段，以Gefitinib(商品名易瑞沙，由阿斯利康公司生產(chǎn))和Erlotinib(商品名特羅凱，由羅氏公司生產(chǎn))為代表的酪胺酸激酶抑制劑(Tyrosine?kinase?inhibitor，TKI)是目前被多國批準并被廣泛應(yīng)用于進展或難治性非小細胞肺癌的小分子靶向藥物。

最初的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，經(jīng)化療失敗的非小細胞肺癌病人對TKI藥物治療的總有效率可達10％以上，而對TKI藥物有效的病人可在癥狀改善、病灶控制和生存時間等方面獲得明顯益處。東方人種、腺癌、女性和不吸煙是TKI藥物治療的優(yōu)勢人群，通過這種優(yōu)勢人群的選擇可使TKI藥物的有效性升高到40％以上。2004年，在“科學(xué)”和“新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志”等期刊上發(fā)表了幾篇關(guān)于EGFR突變與TKI藥物敏感性關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)EGFR突變的病人使用TKI藥物的有效性高達71--100％。

現(xiàn)在已有許多大型醫(yī)療中心正在采用EGFR檢測進行TKI藥物治療病人的選擇，實踐證明，通過EGFR檢測可使TKI的有效率提高到80％以上。

目前有關(guān)EGFR突變的檢測方法采用的均是核苷酸測序方法，即對EGFR外顯子19和21進行PCR擴增，之后對PCR產(chǎn)物進行測序。應(yīng)用核苷酸測序的方法檢測EGFR外顯子19和21突變有如下缺點：1)如果樣本基因組DNA發(fā)生的是EGFR雜合性突變，就會出現(xiàn)兩種PCR產(chǎn)物，而基因測序一般只能測出其中一種產(chǎn)物的序列。因此這種方法的缺點是：1)不能檢測出雜合子的情況2)在雜合子情況下，測序信號可能有紊亂。3)在雜合子存在的情況下可能出現(xiàn)假陰性，即正常的EGFR序列可能隨機成為檢測結(jié)果。應(yīng)用核苷酸測序的方法還存在費用較高，耗時較長的缺點。目前提供核苷酸測序服務(wù)的公司都集中在北京、上海等大型城市，國內(nèi)目前有許多省會城市沒有提供核苷酸測序服務(wù)的公司，這將導(dǎo)致檢測周期過長的缺點。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決在檢測EGFR突變中存在的上述問題，我們發(fā)明了一種直接用PCR法即可以檢測出EGFR突變情況的技術(shù)，該技術(shù)的要點是，直接根據(jù)EGFR外顯子19、21已知存在的3個突變類型的突變位點設(shè)計出特異性引物，特異性引物只擴增相對應(yīng)的突變類型，經(jīng)過電泳即可鑒定是哪一類的類型突變。與前述的測序方法相比，該方法經(jīng)濟、簡單、快速，根據(jù)EGFR正常序列的引物還可以清晰地判斷出突變類型是雜合性突變還是純合性突變。

根據(jù)Gene?Bank檢索人EGFR?19、21外顯子的正常核苷酸序列，根據(jù)相應(yīng)文獻報道確定EGFR外顯子19、21突變的序列。EGFR外顯子19突變類型為E746-A750缺失突變、L747-S752缺失突變；EGFR外顯子21為L858R點突變。根據(jù)這些突變的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，用于擴增特異性的核苷酸序列。

本發(fā)明設(shè)計的引物如下：

EGFR外顯子19野生型上游引物：5`ttcccgtcgctatcaaggaattaag?3`

外顯子19E746-A750缺失突變上游引物：5`gttaaaattcccgtcgctatcaaaa?3`

外顯子19L747-A752缺失突變上游引物：5`gttaaaattcccgtcgctatcaagac?3`

EGFR外顯子19通用下游引物：5`GCTCA?CCAAG?AGCAC?TCACT?CATCA?3`

EGFR外顯子21野生型上游引物：5`CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT?3`

EGFR外顯子21L858R突變上游引物：5`CATGT?CAAGA?TCACA?GATTT?TGGGCG?3`

EGFR外顯子21通用下游引物：5`cagtggaccaccaaggcagctgtgac?3`

取病人血液標本，提取基因組，應(yīng)用常規(guī)PCR反應(yīng)條件做PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物做電泳檢測，即可判斷出其是否發(fā)生突變，突變的類型、突變?yōu)榧兒闲赃€是雜合性。

根據(jù)上述引物所設(shè)計的PCR試劑盒，可用于人基因組中EGFR外顯子19和21常見突變的檢測。

附圖說明