[發明專利]低氧間充質干細胞的培養方法、用途及組合制劑

無效

• 申請號: 201010130535.2
• 申請日: 2010-03-24
• 公開（公告）號: CN101792737A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 晏澤
• 申請（專利權）人: 晏澤
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/50;A61K35/44;A61P43/00;A61K31/198;A61K31/401;A61K31/405;A61K31/4172
• 代理公司: 廣州市一新專利商標事務所有限公司 44220
• 代理人: 王德祥

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技術領域

本發明涉及干細胞應用技術領域，尤其是一種低氧間充質干細胞的培養方法、用途及組合制劑。

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背景技術

間充質干細胞是干細胞家族的重要成員，源于發育早期的中胚層和外胚層。間充質干細胞是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，屬于非終末分化細胞，它既有間質細胞，又有內皮細胞及上皮細胞的特征。間充質干細胞在體外特定的誘導條件下，可分化為成纖維細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、肌肉細胞、神經細胞、肝細胞、心肌細胞、胰島β細胞和內皮細胞等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。間充質干細胞免疫源性低，不論是自體還是同種異源的間充質干細胞，一般都不會引起宿主的免疫反應。間充質干細胞有向衰退、缺血或損傷組織歸巢的特征。間充質干細胞輸入宿主體內后，可以歸巢在特定部位，在微環境影響下有可能分化成為心肌、肝、腎、胰島、神經、皮膚、肌肉、骨、軟骨、肌腱等組織器官的細胞，達到治療疾病的目的。

在臨床應用方面，當前國內外的臨床研究主要集中在用間質干細胞來治療診斷明確的疾病上，尤其是難治疾病，如移植物抗宿主反應（GVHD）、牙周疾病、心肌梗死、半月板損傷、骨或軟骨缺損、股骨頭壞死、脊髓損傷、腦癱、克隆氏病、肌萎縮側索硬化癥、系統性紅斑狼瘡、系統性硬化癥、中風、糖尿病、糖尿病足壞疽或肝臟損傷等疾病，部份疾病已取得明顯的療效，其余也得到了部分改善或緩解。大家公認的間充質干細胞在機體內的作用機制有：①干細胞分化為功能性細胞，代替衰退、損傷的功能性細胞；②啟動再生相關基因的順序表達，使組織器官的內源性衰退、損傷修復啟動；③外源性干細胞進入體內，分泌多種生長營養因子，改善組織器官內部微環境；④免疫調節作用可減輕了局部組織器官的炎性反應。

當前針對間充質干細胞用于防治機體功能性衰退的研究尚少。機體功能性衰退（包括了亞健康、生理性衰退及疾病前期）與疾病的發生密切相關，可以說機體功能性衰退是疾病的前期，機體可同時存在機體功能性衰退和疾病兩種情況，兩者可互為因果條件相互促進，伴隨著機體的整個生命周期。我們在進一步的研究中發現：①靜脈輸注的骨髓、外周血動員或體外培養的間充質干細胞，只有極少數間充質干細胞能植入受者體內，多數細胞滯留于微血管處而死亡。②間充質干細胞有貼壁生長的特性，間充質干細胞在靜脈輸注中會出現粘附、聚集成團，出現細胞團栓塞的可能。③胎盤、臍帶來源的間充質干細胞取材方便、無道德倫理問題的限制，細胞的分化潛力、活力、增殖能力和細胞內的活性營養因子種類及含量，都強于來源于成體的間充質干細胞。目前還尚未發現有人將源于胎盤、臍帶的間充質干細胞用于抗衰老目的。

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發明內容

本發明的任務是要克服現有技術的缺陷，提供一種在人體內的活力及植入成活率高，具有防治機體功能性衰退，不會滯留于微血管處而死亡，在靜脈輸注中不會出現粘附、聚集成團從而導致細胞團栓塞，細胞的分化潛力、活力、增殖能力和細胞內的活性營養因子種類及含量都強于來源于成體的低氧間充質干細胞的培養方法、用途及組合制劑。

本發明的技術方案是：

一種低氧間充質干細胞的培養方法，其特征是：在3-10%氧濃度的低氧條件下，按如下步驟培養：a、無菌操作將臍帶或胎盤切成組織塊，用Hank^，s液沖洗后去除殘留血液并分離血管；b、將處理后的組織塊用胰蛋白酶消化，觀察細胞大部分分散時，終止消化；c、對消化后的物質過濾；d、將所得濾液低速離心；e、在離心后的濾液中加入細胞培養液制成細胞混懸液；f、將細胞混懸液按（1：2～4）的比例歷時約14-15天，進行4-5代傳代，得成品低氧間充質干細胞。

進一步的該優化措施是：

在所述步驟f后還設有檢驗程序：g、對步驟f所得產物進行病源生物檢測，排除病源學污染；h、進行表型檢測，符合CD31、HLA-DR、CD34和CD45陰性，CD44、CD73、CD90和CD105陽性的細胞為合格細胞；i、將合格細胞加入凍存液后置于-205℃～-185℃液氮中保存，并記錄臍帶或胎盤的來源信息、細胞代數、細胞數量以及制備日期。

在于在所述步驟a中，將所述組織塊切成0.5mm³～1.5mm³的小塊。

在所述步驟d后設有步驟d’：用Hank^，s液對間充質干細胞混懸液離心清洗至少1次。

低氧間充質干細胞的用途，其特征是：所述低氧間充質干細胞在防治人或動物機體功能性衰退方面的應用。