[發明專利]一種單鏈微核糖核酸的檢測方法

無效

• 申請號: 201010129816.6
• 申請日: 2010-03-19
• 公開（公告）號: CN101792806A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 寇彤;俞萍;李曉晨;孫克非
• 申請（專利權）人: 天根生化科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 羅文群

技術領域

本發明涉及一種單鏈微核糖核酸的檢測方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

單鏈微核糖核酸(以下簡稱miRNA)是一類具有21-23個單核苷酸長度的核糖核酸分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因信使核糖核酸堿基配對引導沉默復合體(RISC)降解信使核糖核酸或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進化中相當保守，在植物、動物和真菌中發現的miRNA只在特定的組織和發育階段表達，miRNA組織特異性和時序性，決定組織和細胞的功能特異性，表明miRNA在細胞生長和發育過程的調節過程中起多種作用。miRNA序列在不同的生物細胞中具有一定的保守性，miRNA的功能是參與生命的一些基本過程，如發育過程中的細胞增殖、細胞死亡、應激反應和脂肪代謝等。最近的研究發現，miRNA表達與多種癌癥相關，大約50％得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點。這說明miRNAs在腫瘤發生過程中起至關重要的作用，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能。這些研究結果都表明miRNA在細胞癌變中可能發揮著重要的作用。因此，建立一種操作快速簡便、費用低廉的檢測方法對miRNA的功能研究具有重要意義。由于miRNA分子較小，檢測技術的難點高于其余分子的檢測。成熟的miRNA一般只有二十幾個堿基，同族的miRNA之間通常只有一兩個堿基的差別，而且絕大部分在細胞中的表達水平都比較低，這些特性給傳統的檢測方法如核糖核酸雜交，芯片檢測等常規手段帶來了極大的困難和挑戰。

發明內容

本發明的目的是提出一種單鏈微核糖核酸的檢測方法，建立一種用于檢測miRNA分子的簡便、實用的方法，以用于miRNA的表達分析、克隆研究以及臨床標本檢驗。

本發明提出的單鏈微核糖核酸的檢測方法，包括以下步驟：

(1)將包含單鏈微核糖核酸的核糖核酸加入到多聚腺苷酸聚合酶反應系統中，在37℃反應50-70分鐘，得到反應液，所述的多聚腺苷酸聚合酶反應系統的體積為20微升，核糖核酸加入的質量體積比為2納克～200納克/微升，多聚腺苷酸聚合酶反應系統的組成為：多聚腺苷酸聚合酶為2單位、核糖核酸為20納克～2微克、pH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽100毫摩爾/升、氯化鈉200毫摩爾/升、乙二胺四乙酸80毫摩爾/升和三磷酸腺苷為50毫摩爾/升；

(2)從步驟(1)的反應液中取出2微升，加入到逆轉錄反應系統中，在37℃反應50-70分鐘，得到反應液，逆轉錄反應系統的體積為20微升，步驟(1)的反應液的加入體積比為1∶10，逆轉錄反應系統的組成為：步驟(1)的反應液2微升、逆轉錄引物150納摩爾/升、pH值為8.8的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽150毫摩爾/升、氯化鉀500毫摩爾/升、三磷酸脫氧核糖核苷為100微摩爾/升、核糖核酸酶抑制劑為20單位和Quant逆轉錄酶為2單位；

(3)從步驟(2)的反應液中取出2微升，加入到聚合酶鏈式反應系統中，反應程序為40個熱循環，每個熱循環的條件為94℃保溫20秒，60℃保溫30秒，72℃保溫30秒，步驟(2)反應液的加入體積比為1∶10，聚合酶鏈式反應系統的組成為：步驟(2)的反應液2微升、脫氧核糖核酸聚合酶混合液10微升、上游引物摩爾濃度為200納摩爾/升和通用型下游引物摩爾濃度為200納摩爾/升。

本發明提出的單鏈微核糖核酸的檢測方法，其優點是檢測簡便、快捷、節約。本發明方法是基于SYBR?Green?I染料法的miRNA熒光定量檢測系統，可用于從一個合成反應的單鏈脫氧核糖核酸中檢測多種miRNA，不僅減少了檢測誤差、節約了檢測樣品，同時還實現了檢測的高通量。而且本發明方法具有較好的檢測特異性，能分辨單堿基差異的miRNA；檢測靈敏度高，可在低至納克級的總核糖核酸中檢測到特異表達的miRNA。

附圖說明

圖1是單鏈微核糖核酸mir-24和mir-122熒光定量檢測的擴增曲線。

圖2是單鏈微核糖核酸mir-24和mir-122熒光定量檢測的溶解曲線。

具體實施方式

本發明提出的單鏈微核糖核酸的檢測方法，包括以下步驟：