[發(fā)明專利]檢測(cè)殘留的鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010128312.2
• 申請(qǐng)日: 2010-03-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101799469A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/543
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/543;G01N33/557;G01N33/52
• 代理公司: 北京銀龍知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)殘留的鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked?Immunosorbent?Assay，ELISA)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)動(dòng)物源食品、血液及尿液中殘留的鹽酸克倫特羅(CBL)的含量的酶聯(lián)免疫試劑盒以及使用該試劑盒的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

鹽酸克倫特羅(clenbuterol，CBL)是一種β-2腎上腺受體激動(dòng)劑，臨床上作為支氣管解痙藥物，對(duì)支氣管平滑肌β-2受體具有興奮作用。有研究顯示鹽酸克倫特羅能增強(qiáng)脂肪分解和減慢蛋白質(zhì)分解代謝，在畜牧生產(chǎn)中大劑量使用可以明顯提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，因此又被稱為瘦肉精。

但是，如果鹽酸克倫特羅的用量過(guò)大，則會(huì)對(duì)動(dòng)物和人的肝臟、腎臟等器官造成相當(dāng)大的毒害作用，出現(xiàn)心跳加速、頭暈、心悸、呼吸困難、肌肉震顫和頭疼等中毒癥狀。鹽酸克倫特羅還可通過(guò)胎酶標(biāo)板屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)產(chǎn)生蓄積，從而對(duì)子代產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。歐盟于1996年禁止在畜牧生產(chǎn)中使用該藥，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也于1997年作出相同規(guī)定。但由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，目前在畜牧生產(chǎn)中使用鹽酸克倫特羅的現(xiàn)象仍然存在，每年都有大規(guī)模中毒事件發(fā)生。

當(dāng)前，造成瘦肉精屢禁不止的原因之一就是國(guó)內(nèi)外檢測(cè)鹽酸克倫特羅的方法、手段還不完善。存在的問(wèn)題主要有：檢測(cè)方法靈敏度不高，準(zhǔn)確度不夠；特異性差，操作復(fù)雜，不能普及到基層。目前鹽酸克倫特羅的檢測(cè)方法主要有：色譜技術(shù)和免疫分析技術(shù)。色譜技術(shù)由于費(fèi)時(shí)，花費(fèi)多，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制，通常作為確定性的定量檢驗(yàn)方法；酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)是常用的現(xiàn)場(chǎng)抽樣快速篩選檢驗(yàn)方法，目前我國(guó)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫，獸醫(yī)衛(wèi)生部門(mén)及屠宰場(chǎng)多采用德國(guó)R-Biopharm公司生產(chǎn)的鹽酸克倫特羅ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：R1701)，但由于進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴，在一定程度上限制了它的使用范圍。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種能夠快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)出殘留的鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短且檢測(cè)靈敏度高的檢測(cè)殘留的鹽酸克倫特羅的方法。

為解決所述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)深入研究和大量實(shí)驗(yàn)，提供以下技術(shù)方案來(lái)解決所述技術(shù)問(wèn)題：

1.一種檢測(cè)殘留的鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括微孔板(1)、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品(2)、濃縮洗滌液(3)、濃縮酶標(biāo)鹽酸克倫特羅(4)、酶標(biāo)稀釋液(5)、底物液(6)和終止液(7)，

其中，所述微孔板(1)是預(yù)先包被葡萄球菌蛋白A，然后包被兔抗鹽酸克倫特羅抗體的微孔板，所述預(yù)先包被葡萄球菌蛋白A是用0.05mol/L的pH值為9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖液將葡萄球菌蛋白A稀釋至1μg/ml，按每孔100μl的量添加到微孔板板(1)中，4℃放置過(guò)夜，棄去包被液，用稀釋后的濃縮洗滌液洗板3次。

2.根據(jù)上述第1項(xiàng)所述的檢測(cè)殘留的鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中，所述微孔板包被兔抗鹽酸克倫特羅抗體是用0.05mol/L的pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)將兔抗鹽酸克倫特羅抗體以1∶50,000比例稀釋，按每孔100μl的量添加到微孔板中，4℃放置過(guò)夜，棄去包被液，用稀釋后的濃縮洗滌液洗板3次，然后真空抽干，將微孔板密封后置-20℃下保存。

3.根據(jù)上述第1項(xiàng)所述的檢測(cè)殘留的鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中，所述鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品(2)的濃度分別為0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg。

4.根據(jù)上述第1項(xiàng)所述的檢測(cè)殘留的鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中，所述濃縮洗滌液(3)是5～10倍濃縮洗滌液，即在使用時(shí)將該濃縮洗滌液稀釋5～10倍；

所述酶標(biāo)稀釋液(5)是由小牛血清和所述洗滌液按體積比1∶9組成；

所述濃縮酶標(biāo)鹽酸克倫特羅(4)是10～100倍的濃縮酶標(biāo)鹽酸克倫特羅，采用重氮化-偶聯(lián)的方法將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記到鹽酸克倫特羅(CBL)上，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定酶標(biāo)CBL原液的工作濃度，將酶標(biāo)CBL原液用含10％小牛血清(體積比)的PBS稀釋至工作濃度(濃度在0.1μg/mL～1μg/mL范圍內(nèi))的10～100倍，該酶標(biāo)CBL溶液即為10～100倍濃縮酶標(biāo)CBL；