[發(fā)明專利]小分子RNA的提取方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010126276.6
• 申請(qǐng)日: 2010-03-15
• 公開（公告）號(hào): CN102191238A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏東元;維克多·韓;范盤生;張穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 博爾誠(chéng)（北京）科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C07H21/02;C07H1/06
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種小分子RNA的提取方法，具體地，本發(fā)明涉及無酚/氯仿抽提的小分子RNA的提取方法。

背景技術(shù)

由于小分子RNA可能參與分化、發(fā)育、組織生長(zhǎng)、脂肪代謝等生理過程，在不同的組織和發(fā)育階段的表達(dá)水平有所不同，進(jìn)一步了解小分子RNA的生物功能具有重要意義。

微小RNA(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)是生物體內(nèi)源長(zhǎng)度約為20-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。由于微小RNA存在的廣泛性和多樣性，提示微小RNA可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對(duì)微小RNA的研究還處于初級(jí)階段，據(jù)推測(cè)微小RNA在高級(jí)真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要并可能代表在一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。對(duì)一部分微小RNA的研究分析提示：微小RNA參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡，脂肪代謝和細(xì)胞分化以及和癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

可見，對(duì)小分子RNA的研究日益受到重視。然而，進(jìn)行小分子RNA分析的第一個(gè)關(guān)鍵步驟就是從生物樣本中純化小分子RNAs。多數(shù)傳統(tǒng)RNA分離試劑盒目的是為回收mRNA而設(shè)計(jì)的，往往會(huì)棄去較小的RNA分子以減少干擾提高mRNA得率。因此這些步驟會(huì)導(dǎo)致一些小分子RNAs，如微小RNAs的損失。另外，此類方法往往涉及酚/氯仿等有毒化學(xué)物質(zhì)的抽提。多數(shù)RNA純化試劑盒采用的標(biāo)準(zhǔn)玻璃纖維濾膜或者硅膠濾膜，不能有效的回收更小的小分子RNA，如微小RNA。例如，利用這些方法雖然能有效回收5.8S?rRNA，但微小RNA部分或者全部被棄除。

隨著對(duì)小分子RNA，尤其是微小RNA研究的逐漸深入，小分子RNA的分離技術(shù)逐漸成為一種需求。微小RNA的分子量相對(duì)較小，對(duì)于常規(guī)的核酸提取法都不適用。微小RNA只有在乙醇濃度很高的條件下(大于70％)才能與核酸提取柱相結(jié)合，從而得到分離。但在該濃度的乙醇條件下，絕大多數(shù)的其他分子，特別是大分子都會(huì)被沉淀，使分離無法進(jìn)行。目前多采用利用毒性很強(qiáng)的酚以及氯仿等有機(jī)試劑，首先將大分子沉淀除掉，然后純化總的核酸。除了使用的試劑有毒外，大分子的DNA和RNA仍然會(huì)影響對(duì)微小RNA的進(jìn)一步分析。

因此，有必要開發(fā)新的小分子RNA的提取方法。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明的目的是提供一種小分子RNA的提取方法。

本發(fā)明的方法是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明提供一種小分子RNA的提取方法，其不使用酚/氯仿處理樣品，具體地，所述方法包括以下步驟：1)采用裂解液處理樣品后，再用濾膜過濾樣品，除去樣品中的大分子組分，得到小分子組分；2)進(jìn)一步純化小分子組分，得到小分子RNA。

優(yōu)選地，所述步驟1)中濾膜的截流分子量為20K到100K，優(yōu)選為30K和50K。

優(yōu)選地，所述步驟2)中小分子組分的純化是通過以下方法來實(shí)現(xiàn)的：先采用有機(jī)溶劑處理小分子組分，再直接通過核酸結(jié)合柱純化。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑選自乙醇和異丙醇。

優(yōu)選地，所述核酸結(jié)合柱選自RNA結(jié)合柱和DNA結(jié)合柱。

優(yōu)選地，所述小分子RNA包括微小RNA、小干擾RNA和小核RNA。

優(yōu)選地，所述樣品為生物樣品，選自細(xì)胞、組織提取物、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液、腹水、腦集液及淚液分泌物。

由此可見，本發(fā)明采用濾膜法，首先將樣品中含量豐富的大分子組分如DNA和蛋白與分子量較小的小分子組分分開，微小RNA存在于小分子組分中。含有微小RNA的小分子組分經(jīng)乙醇處理后，直接通過RNA的特異結(jié)合柱(RNA特異結(jié)合柱包括所有RNA結(jié)合柱)加以純化，具體的提取過程如圖1所示。本發(fā)明對(duì)于液態(tài)生物樣品，例如組織，血清，血漿，唾液和尿液等更有其特點(diǎn)。可直接經(jīng)樣品裂解液作用將樣品中的微小RNA與其結(jié)合的大分子蛋白或DNA分子分離，游離的微小RNA在高濃度的乙醇存在下可以與微小RNA的特異結(jié)合柱結(jié)合，并得以純化。

更重要的是，本發(fā)明不涉及有毒的化學(xué)成分，如：酚和氯仿等的使用。本發(fā)明為高效快捷的微小RNA分離純化方法，對(duì)各種不同來源的樣品(動(dòng)物、植物、細(xì)胞等)，尤其是液體樣本，均能取得滿意的提取效果。對(duì)各種小分子RNA，包括微小核糖核酸(微小RNA，miRNA)、小干擾核糖核酸(小干擾RNA，small?interfering?RNA，siRNA)、小核核糖核酸(小核RNA，small?nμlcear?RNA，snRNA)均能實(shí)現(xiàn)較好的回收。