[發明專利]防治梨枯梢病害的生防菌株SM16

有效

• 申請號: 201010125070.1
• 申請日: 2010-03-16
• 公開（公告）號: CN101864377A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 郭堅華;李師默;陳云
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P1/00;C12R1/125
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及一種防治梨枯梢病的枯草芽孢桿菌生防菌株SM16，屬于果樹病害防控技術領域，專用于梨枯梢病害無公害防治。

二、背景技術

梨枯梢病害是由歐文氏屬細菌引起病害，該病對于梨產業影響較大。病菌在梨樹花期初侵染，受侵染花器產生水漬狀病斑，不久萎焉變黑枯死。在潮濕條件下，受侵染花器、果柄、葉柄等組織上有菌膿滲出。感染的梨枝梢萎焉枯死，枯葉不脫落。枝梢枯萎發展較快，條件適宜時，幾天內即可擴展15-30cm以上，造成整枝死亡。有時，病害僅局限于簇芽或新梢，在簇芽或新梢與二年生枝梢交界處形成潰瘍斑，可能為病菌越冬提供場所。該病害目前在我國發生面積及區域較小，但危害十分嚴重。梨枯梢將成為影響我國梨產業的重要病害之一。

目前，化學防治梨枯梢病害主要以農用鏈霉素為主要，其防效能達到80％左右。但是，農用鏈霉素的長期單一使用已導致使用次數和用藥濃度增加，也提高了病原菌產生對農用鏈霉素抗性的風險。同時，由于鏈霉素的廣譜性，大量使用不但破壞了微生態環境，而且導致非靶標抗性。歐盟已經禁止了農用鏈霉素在農業中的使用，并將農產品中農用鏈霉素殘留作為農產品進出口貿易中的壁壘。非化學性防治措施目前已成為防治梨枯梢的核心，其中對環境友好、無農殘、防效較好的生物防治則為最有前途的方法之一。國外利用拮抗細菌生物防治由歐文氏病菌引起的植物病害研究報道較多，生防菌主要集中在假單胞菌屬、芽孢桿菌屬及泛菌屬。在美國，P.fluorescens?A506、P.agglomeransE325、Bacillus?subtilis?QST713正在進行農藥登記；在歐盟，生防菌劑Serenade和Biopro已被產業化用來防治由歐文氏病菌引起的梨樹病害。現有技術中按照本實驗室的菌體保藏液專利(公開專利號CN1358838，公開日：2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存2～3年。

三、發明內容

技術問題：本發明的目的是生物防治梨產業潛在危害較大的梨枯梢病害，通過室內離體和果園試驗，篩選得到的枯草芽孢桿菌SM16的菌劑防治該病害效果較好，防效可達50％以上。

技術方案

一種防治梨枯梢病害的生防菌株SM16，為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)，2009年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC?NO.3127。

生防菌株SM16用于制備生防菌劑的方法為：

1)將該菌株接種到LB培養液中30℃培養180rpm振蕩培養，12～16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；

2)當培養至OD值在0.5～0.8之間時，將種子菌液以1∶100體積比加入裝有發酵培養液的200L發酵罐中，30℃250rpm振蕩培養20～24小時，發酵液pH值維持在7.0，溶氧量20％，通氣量5-7m³/小時，罐壓0.05-0.1KPa。然后6000rpm離心10min，每1000ml培養液獲得13～16g濕菌，每克濕菌含4×10¹⁰～10¹⁵個菌體，取濕菌與菌體保藏液按1g∶40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×10⁹～1×10¹²cfu/ml。其中：

種子培養LB培養液配方：氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調節pH值為7.0；

發酵培養液配方：麥芽糖2.5g/L，玉米粉5g/L，黃豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水氯化鈣0.5g/L，一水硫酸錳0.5g/L，磷酸氫二鉀1g/L，調節pH值為7.0；

菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0.001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。

有益效果

本發明的優點和積極效果表現在：本發明是專門針對梨枯梢病害開發的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于梨的無公害生產，農民可以不用或減少其他化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利于梨的出口貿易。

溫室離體花試驗顯示，生防菌SM16生防菌劑噴霧至自然發病花表面，能有效防治病害，防效達66.81％(表1)；室內離體葉片試驗顯示，SM16生防菌劑能有效抑制自然發病梨嫩葉上病斑的延伸(圖2.)；自然發病果園試驗中，噴霧生防菌劑SM16防效顯著，高達60-70％(表2)。