[發明專利]全基因合成犬α干擾素基因及蛋白表達

無效

• 申請號: 201010125025.6
• 申請日: 2010-03-16
• 公開（公告）號: CN101798573A
• 公開（公告）日: 2010-08-11
• 發明（設計）人: 姚火春;張煒;潘子豪;胡偉娟
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/21
• 分類號: C12N15/21;C12N15/63;C12N15/70
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一技術領域

本發明屬于基因工程生物制藥領域，涉及利用全基因合成技術獲得犬α干擾素基因及其干擾素蛋白的原核表達。

二背景技術

近年來，養犬業在我國發展迅速，犬的種類和數量也越來越多，不論是作為伴侶動物還是兇猛靈敏的警用犬，都對現代社會起著不可或缺的作用，而病毒病如犬細小病毒病、犬瘟熱、犬冠狀病毒病等都嚴重危害著犬的健康和生存，病毒病的預防和治療顯得尤為重要。干擾素系統是機體對抗病毒感染的重要防御系統，當干擾素系統被激活后，血清干擾素可以在幾分鐘之內擴散到身體各器官，而細胞接觸干擾素只需幾分鐘就可產生抗病毒狀態，而且，動物可以在一到三周內對其他病毒的重復感染有抵抗作用。根據干擾素的氨基酸序列、抗原性和細胞來源的不同可將其分為2個型：I型干擾素的主要成員為α干擾素和β干擾素，II型干擾素為γ干擾素。而其中α干擾素(IFN-α)以其突出的抗病毒作用而備受人們重視。

由誘生劑誘導產生的天然犬IFN-α，因來源少、成本高、純化工藝復雜等諸多原因而價格昂貴，極大的限制了臨床和科研的應用，而利用基因工程技術選擇一個合適的系統，使其得到高效表達，生產具有廉價、廣譜抗病毒活性、無毒害、無殘留等優點的干擾素已經無疑是促使干擾素在獸醫臨床上推廣應用的有效途徑。

三發明內容

本發明的目的之一在于對犬α干擾素基因序列進行密碼子改造后，通過全基因合成技術合成此序列并構建高效表達載體，實現干擾素在大腸桿菌的高表達，獲得具有抗病毒活性的犬α干擾素蛋白。

本發明的另一目的是提供一種通過全基因合成技術合成的經過改造的核酸，其特征在于：所述核酸包含編碼犬α干擾素的閱讀框，并且在該閱讀框內全部采用大腸桿菌偏愛的密碼子。

優選的，上述閱讀框的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明的另一目的是提供一種含有上述核酸的重組載體。

本發明的另一目的是提供一種含有上述重組載體的大腸桿菌。

本發明還提供一種在原核表達系統中提高犬α干擾素表達量的方法，其包含如下步驟：(1)在不改變犬α干擾素氨基酸序列的基礎上設計其編碼核酸序列，使閱讀框內的每個密碼子都采用大腸桿菌偏愛的密碼子；(2)人工合成步驟(1)中設計的編碼核酸；(3)將步驟(2)合成的核酸插入適當的表達載體，構建重組表達載體；(4)將步驟(3)構建的重組表達載體轉化適當的大腸桿菌進行誘導表達。

本發明的技術方案如下：

(一)犬α干擾素基因的合成

(1)登錄GeneBank，查找編碼犬α干擾素成熟蛋白的基因序列；

(2)利用SignalP?3.0Server軟件預測此基因序列有無信號肽及其位置；

(3)利用TargetP?1.1Server軟件檢測此信號肽的功能；

(4)將犬α干擾素的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進行比對，根據密碼子的兼并性，將犬α干擾素密碼子替換為大腸桿菌偏好的密碼子；

(5)將替換后的序列5′、3′端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點，送生物公司進行全基因合成；

(二)犬α干擾素的原核表達

(1)重組質粒pET32a-CaIFN-α轉化大腸桿菌BL21(DE3)；

(2)陽性重組菌誘導表達，最佳誘導時間的確定及表達蛋白可溶性鑒定；

(3)重組陽性菌穩定性檢測；

(三)重組犬α干擾素的提取

(1)菌體破碎；

(2)包涵體洗滌；

(3)包涵體變性；

(4)目的蛋白透析復性及蛋白濃度測定；

(四)重組犬α干擾素抗病毒活性測定

利用微量病變抑制法測定干擾素活性

(1)培養MDCK細胞；

(2)接種96孔細胞板；

(3)濾泡性口炎病毒(VSV)對MDCK半數致死量的測定；

(4)干擾素抗VSV活性測定，將抑制50％細胞病變的干擾素的最高稀釋度定為1個干擾素單位。

四附圖說明

圖1是重組犬α干擾素蛋白表達SDS-PAGE電泳圖

泳道1：誘導表達前；

泳道2-7：誘導表達1，2，3，4，5，6小時；

泳道7：蛋白質分子量標準(Marker)。

重組菌經誘導表達后在分子量32kD處有增加的蛋白表達條帶，與預期的蛋白分子量一致(干擾素分子量18.0kD，加上載體本身的融合標簽14.3kD)，且在6小時時表達量最高，所以選用的最佳誘導時間為6小時。

圖2是重組犬α干擾素蛋白可溶性鑒定圖