[發明專利]小型化高通量核酸分析

有效

• 申請號: 201010124293.6
• 申請日: 2010-02-25
• 公開（公告）號: CN101845494A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: T·弗羅利克;D·海因德爾;A·羅斯勒
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 張萍;李連濤

技術領域

本發明涉及核酸分析領域，具體來說是小型化的、高度平行的核酸序列檢測以及核酸序列差異分析。

本發明基于如下想法：提供固體支持物，其結合有序列特異性引物，所述引物的一種是可裂解的，另一種是不可裂解的，從而分析特定序列或檢測SNP、突變或任何所關注的特定DNA或RNA物質的存在。

背景技術

最近，公開了一種基于焦磷酸鹽測序的超高通量的測序系統，該系統使得能夠基本上在不大于一周的時間對細菌基因組進行測序(WO?04/70007；WO?05/03375；Margulies，M.，等人，Nature?437(2005)376-80)。由剪切的基因組DNA開始，單分子片段結合至珠子，該珠子被捕獲在油中的PCR反應混合物乳液中。然后，擴增得到克隆擴增的DNA的文庫，其中各珠子攜帶多拷貝的相同片段。

在乳液破乳(breakage)和PCR產物變性成單鏈之后，將珠子沉積在光纖皮可滴定板(picotiter?plate)的多個孔內，使得一個孔中攜帶不大于一個的珠子。然后，在通過合成反應進行的測序中，進行引物延伸反應，其中在一連串的反復事件中提供4種不同的A、G、C和T三磷酸核苷或它們各自的類似物，新生鏈的序列由通過DNA聚合酶催化的延伸反應所衍生的化學產物來推斷。具體而言，通過合成反應進行的測序是焦磷酸鹽測序反應，其特征在于如下檢測焦磷酸鹽的生成：

PPi+腺苷5’磷酸硫酸酯(phosphosulfate)(APS)→ATP，在腺苷三磷酸雙磷酸酶(Apyrase)的存在下催化

ATP+螢光素→光+氧化螢光素，在螢光素酶存在下催化

檢測氧化螢光素的發光

使用WO?04/70007和WO?05/03375中所公開的超高通量測序系統，可以同時進行大于1?000?000個的焦磷酸鹽測序反應。焦磷酸鹽的產生觸發發光反應級聯，最后用CCD相機檢測光。

關于此技術，WO?04/69849公開了一種在單個反應管中以快速和經濟的方式擴增多種核酸的方法(例如，DNA文庫、轉錄組、基因組的各序列)。更具體地，WO?04/69849公開了在一個反應容器中同時進行多個樣品(多至幾十萬)的克隆擴增(例如，通過PCR)。在這方面，WO?04/69849提供了如下的方法：將多個DNA樣品各自封裝在乳液微膠囊(即，微反應器)中，同時進行多個封裝的核酸樣品的擴增，從微膠囊釋放所述擴增的多種DNA以用于隨后的反應。例如，使單拷貝的(各)核酸模板物質雜交到捕獲珠子上，所述珠子包含：例如，與核酸模板結合的化學基團或捕獲寡核苷酸。將珠子懸浮在完全擴增溶液中，進行乳化以產生微反應器(直徑通常為100至200微米)。此后，利用擴增(例如，PCR)來克隆增加微反應器中初始模板物質的拷貝數，這些拷貝結合在微反應器中的捕獲珠子上。或者，將捕獲珠子添加到包含核酸模板的擴增反應混合物中，將此混合物乳化以產生微反應器。利用擴增(例如，PCR)來克隆增加微反應器中初始模板物質的拷貝數，這些拷貝結合在微反應器中的捕獲珠子上。因此，根據WO?05/03375的微反應器使得能夠同時克隆和離散擴增許多不同模板而不會交叉污染擴增的產品或試劑或使一種特定的模板或模板組占主導(例如PCR偏向)。

然而，根據WO?05/03375，需要進行銜接子連接步驟，其中用銜接子序列標記多種不同的核酸分子，該銜接子序列隨后可與具有共價連接的互補銜接子序列的珠子結合。

另一重要的DNA分析技術是分析型聚合酶鏈式反應(PCR)。然而，目前的PCR定量是基于類似(analogous)測量模式。但是在一些情況下，在諸如下列領域非常需要數字計數原理：

-癌癥檢測：在過量的野生型背景中進行的突變體等位基因定量

-等位基因失衡檢測

-稀有轉錄本和/或轉錄本中突變體等位基因的基因表達

-病毒檢測和定量

因此，DNA/cDNA/mRNA的數字計數的可用性解決了分子醫藥中未解決的需求，例如，癌癥診斷的高度相關性、循環腫瘤細胞、出生前胚細胞，其中具體事件需要在高背景中檢測。

因此，本發明的一個目的是提供同時分析多種核酸分子的改良方法和改良試劑。

在具體方面，本發明的目的是提供一種固體支持物或多種固體支持物，其可用于改善上述測序流程或能夠進行數字PCR計數。