[發明專利]用于檢測EB病毒的引物、試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201010122194.4
• 申請日: 2010-02-26
• 公開（公告）號: CN102168149A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 倪劍鋒;趙珊珊;楊文輝;謝育媛;鄧其濤
• 申請（專利權）人: 寧波基內生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 曹津燕

技術領域

本發明屬于生物技術領域。具體地，本發明涉及用于檢測愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr?virus，EBV，在此簡稱EB病毒)的引物、試劑盒及方法。

背景技術

EB病毒(Epstein-Barr?virus，EBV)屬于γ皰疹病毒亞科的成員之一，是人類的一種特異性嗜淋巴細胞性皰疹病毒，一直被認為是人類某些嚴重疾病以及腫瘤的致病因子，與許多疾病的發生都有著密切的關系，威脅著人類的健康。EBV主要通過人類唾液傳播，因此呼吸道是EBV潛伏的最大場所。調查結果顯示，世界人口的90％以上都存在EBV的潛伏感染，或成為EBV攜帶者。更重要的是EBV感染與越來越多的人類惡性腫瘤有關，應用原位雜交證明了攜帶高拷貝EBV除了能轉化淋巴細胞外，也能賦予腫瘤細胞一定的生長優勢，使其成為優勢細胞群，呈現轉化特征。EBV引發了全球癌癥的1％，并占所有感染性癌癥的5.6％。根據國際癌癥研究署對致癌因子的分類標準，EBV被列在第一組致癌因子中。

隨著近幾年癌癥在全球的急劇蔓延，EBV感染的早期檢測和預防成為當務之急。目前ELISA檢測EBV各項抗體是臨床診斷EBV感染的重要指標之一，但它實際上檢測的是人體對EBV感染的免疫反應狀態，無法檢測病毒自身，也就無法準確靈敏地反映EBV感染的情況。由于鼻咽癌外周血循環的游離EBV-DNA的拷貝數隨著全身化療周期的進行而呈現動態變化，所以檢測鼻咽癌患者EBV-DNA的表達水平對判斷病灶殘留、復發、轉移、判斷治療的敏感性、綜合治療方案的及時更改、確認以及判斷療效、預后均具有重要的指導意義，EBV目前已經成為鼻咽癌診治中重要的血清分子標志物，可以作為診斷和治療中的一項參考依據。

目前國外已經上市的檢測EBV-DNA的試劑盒有幾種，檢測的方法主要是熒光免疫雜交(HIGH)，國內檢測EBV主要采用ELISA方法，未見有批準上市檢測EBV-DNA的試劑盒。基于EBV感染情況如此嚴重，開發一種簡單、易行、成本較低的檢測方法就顯得尤為重要。

發明內容

因此，本發明的一個目的在于提供一種用于檢測EB病毒的引物或其組合物。

本發明的另一個目的在于提供上述引物或其組合物在制備用于檢測EB病毒的工具中的用途。

本發明的另一個目的在于提供一種用于檢測EB病毒的試劑盒。

本發明的又一個目的在于提供一種檢測EB病毒的方法。

本發明的目的是采用以下技術方案來實現的。

一方面，本發明提供一種用于檢測EB病毒的引物，該引物的上游引物核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1，下游引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2。

本發明還提供了一種用于檢測EB病毒的引物組合物，該引物組合物包括上述用于檢測EB病毒的引物以及內參引物，該內參引物的上游引物核苷酸序列為SEQ?ID?NO：3，下游引物核苷酸序列為SEQ?ID?NO：4。

另一方面，本發明提供了上述引物或引物組合物在制備用于檢測EB病毒的工具中的用途。

另一方面，本發明提供了一種用于檢測EB病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述用于檢測EB病毒的引物或引物組合物。該試劑盒還可以包括細胞裂解液、核酸結合液、核酸漂洗液和核酸洗滌液和PCR反應液。

又一方面，本發明提供了一種檢測EB病毒的方法，該方法包括以下步驟：1)提取樣本DNA；2)使用上述引物、引物組合物或試劑盒對步驟1)得到的DNA進行PCR擴增；3)檢測步驟2)得到的擴增產物。步驟1)中的樣本優選為人的血液或體液。步驟3)中的檢測方法優選為微流體芯片檢測法。

在本發明的一個優選實施方案中，通過對患者血液中的DNA進行EBV檢測，從而判斷患者是否感染了EBV，具體包括以下步驟：

1)提取人臨床樣本的DNA。

2)將EBV特異性引物和人DNA保守序列特有基因的特異性引物混合，對被測樣本的DNA進行多重PCR擴增，被擴增的目標基因片段大小各不相同。

3)擴增產物通過微流體芯片進行檢測。

4)通過各檢測峰的位置確定檢測到的片段的大小，從而判斷被檢測到的基因，鑒別臨床樣本感染的病毒類別。

5)結果判斷：a)未出現任何特異性峰，說明臨床樣本的DNA沒有提取出來，檢測無效；b)只出現DNA內參特異性峰，說明沒有EBV感染；c)出現DNA內參和EBV特異性峰，說明有EBV感染。