[發(fā)明專利]用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的引物組合物、試劑盒及方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010122180.2
• 申請(qǐng)日: 2010-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN102168147A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 倪劍鋒;趙珊珊;楊文輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 曹津燕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的引物組合物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

人乳頭瘤病毒(human?papilloma?virus，HPV)是一種小的DNA雙鏈病毒，目前已分離出100余種HPV?DNA，其中40多種與宮頸的感染和病變有關(guān)。根據(jù)致病力的大小，HPV可分為高危型和低危型兩種，低危型主要引起生殖道、肛周皮膚和陰道下部的外生性濕疣類病變、扁平濕疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)；高危型主要導(dǎo)致CIN?II、III級(jí)病變和宮頸癌的發(fā)生。持續(xù)高危型HPV感染是CIN進(jìn)一步發(fā)展為宮頸癌的必經(jīng)過程，從感染高危型HPV開始至發(fā)展為宮頸癌的時(shí)間間隔大約為15年，故宮頸癌是可預(yù)防的特殊癌癥。

目前，流行病學(xué)和生物學(xué)已經(jīng)證明HPV感染是引起宮頸癌及其癌前病變的首要原因。因此，對(duì)HPV進(jìn)行檢測(cè)及分型對(duì)于有效的、可靠地篩查宮頸癌具有重要的參考意義。傳統(tǒng)的HPV檢測(cè)方法有巴氏涂片法、液基層細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查、組織病理學(xué)檢查、電鏡直接觀察、放射免疫沉淀法檢查、酶聯(lián)免疫吸附法檢查等，但是這些檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確率均不夠理想。最近幾年，為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，開始采用新的分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)HPV進(jìn)行檢測(cè)，包括核酸雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)PCR法、熒光免疫檢測(cè)法等，但是這些方法仍然操作繁瑣且價(jià)格昂貴。

因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、易行、成本較低的檢測(cè)HPV的方法就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的引物組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述引物組合物在制備用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的工具中的用途。

本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的試劑盒。

本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)人乳頭瘤病毒的方法。

本發(fā)明經(jīng)過大量試驗(yàn)、研究和分析，成功地將一系列能夠用于快速、靈敏、有效檢測(cè)HPV的通用混合引物與經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選出的內(nèi)參引物相組合，開發(fā)出一種用于檢測(cè)HPV的引物組合物及相應(yīng)的工具、試劑盒和方法。利用它們可以檢測(cè)出50多種型別的HPV，它們分別為HPV?6、11、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71、72、73、74、81、83、84、85、89、MM8(Pap155)、MM7(Pap291)、MM4(W13B)、IS39、C6108、C8304、C8061、AE2(82亞型)、AE10(74變體)，其中包括了所有可能導(dǎo)致宮頸癌的高危型和低危型HPV。

本發(fā)明的上述目的是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一方面，本發(fā)明提供的用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的引物組合物，該引物組合物包括用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的混合引物以及內(nèi)參引物，其中用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的混合引物的上游引物核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1，下游引物核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2；內(nèi)參引物的上游引物核苷酸序列為SEQ?ID?NO：3，下游引物核苷酸序列為SEQ?ID?NO：4。

本發(fā)明還提供了上述引物組合物在制備用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的工具中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的引物組合物。該試劑盒還可以包括細(xì)胞裂解液、核酸結(jié)合液、核酸漂洗液、核酸洗脫液和PCR反應(yīng)液。

又一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人乳頭瘤病毒的方法，該方法包括以下步驟：1)提取樣本DNA；2)使用上述引物組合物或試劑盒對(duì)步驟1)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)檢測(cè)步驟2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，上述步驟1)中的樣本優(yōu)選為人宮頸上皮細(xì)胞；上述步驟3)中的檢測(cè)方法可以為瓊脂糖凝膠電泳法或微流體芯片檢測(cè)法，優(yōu)選為微流體芯片檢測(cè)法。

采用本發(fā)明的上述引物組合物及其工具、試劑盒和方法能夠快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地檢測(cè)患者樣品DNA中的HPV?L1保守序列(各分型的病毒株上均有該序列)，從而判斷患者是否感染了HPV，其中具體包括以下步驟：

1)提取人臨床樣本的DNA；

2)將HPV?L1保守序列的特異性混合引物(對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SEQID?NO：1和2)和人DNA保守序列特有基因的特異性引物(對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：3和4)組合，對(duì)被測(cè)樣本的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，被擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段大小各不相同；